Lek. Krzysztof Ossoliński
Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w
poszukiwaniu potencjalnych biomarkerów raka
pęcherza moczowego
Opracowanie jest rozprawą na stopień naukowy doktora nauk medycznych w
dyscyplinie nauki medyczne na podstawie cyklu 5 publikacji.
Promotor: dr hab. n. med. Paweł Wiechno
Warszawa 2023
Spis treści
Wykaz skrótów 5
Wykaz publikacji stanowiących podstawę postępowania w sprawie o nadanie stopnia
naukowego doktora nauk medycznych 7
Aktywność naukowa 8
Dorobek publikacyjny 10
Rozdział 1: Wprowadzenie 13
1.1 Rak pęcherza moczowego: epidemiologia, czynniki ryzyka, histopatologia i aktualne
metody diagnostyczne 13
1.1.1 Epidemiologia raka pęcherza moczowego 13
1.1.2 Czynniki ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego 13
1.1.3 Histopatologia nowotworów pęcherza moczowego 14
1.1.4 Grading i staging raka pęcherza moczowego 16
1.1.5 Diagnostyka raka pęcherza moczowego 19
1.1.6 Markery nowotworowe raka pęcherza moczowego 20
1.1.6.1 Wstęp 20
1.1.6.2 Cytologia moczu 21
1.2 Metabolomika: zastosowanie w badaniach nad nowotworami 24
1.3 Metody analizy chemicznej stosowane w metabolomice 24
1.3.1 Spektrometria mas (MS) 27
1.3.1.1 Obrazowanie MS (MSI) 27
1.3.2 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) 29
1.3.3 Zalety oraz wady poszczególnych metod analizy chemicznej 29
1.3.4 Analiza danych 31
1.3.5 Analiza statystyczna w badaniach metabolomicznych 32
Rozdział 2: Założenia i cel pracy 37
Rozdział 3: Materiały i metody 39
3.1 Protokół badania, przygotowanie materiału 39
Rozdział 4: Wyniki i dyskusja 40
4.1 Analiza metabolomiczna tkanki 40
4.2 Analiza metabolomiczna surowicy 41
4.3 Analiza metabolomiczna moczu 46
Podsumowanie i wnioski 51
Streszczenie 54
Streszczenie po angielsku 56
Piśmiennictwo 58
Załączniki 61
2
Wykaz skrótów
Skrót
ENG
PL
1H NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spektroskopia protonowa magnetycznego
rezonansu jądrowego
AUC
Area Under Curve
Pole pod krzywą
BC
Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego
CIS
Carcinoma in situ
Rak in situ
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Test immunoenzymatyczny
FC
Fold Change
Zmiana wielkości (w kontekście biologicznym)
FDA
Food and Drug Administration
Agencja Żywności i Leków
FISH
Fluorescent In Situ Hybridization
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
GC
Gas Chromatography
Chromatografia gazowa
HG
High Grade
Wysoki stopień złośliwości histopatologicznej
HILIC
Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa oddziaływań
hydrofilowych
HPLC
High-Performance Liquid Chromatography
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
HRMS
High Resolution Mass Spectrometry
Spektrometria mas wysokiej rozdzielczości
hTERT
Human Telomerase Reverse Transcriptase
Ludzka odwrotna transkryptaza telomerazy
KEGG
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
Encyklopedia genów i genomów Kioto
LASIS
Laser Ablation Synthesis in Solution
Laserowa ablacja z syntezą w roztworze
LC
Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa
LG
Low Grade
Niski stopień złośliwości histopatologicznej
MIBC
Muscle Invasive Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego naciekający
mięśniówkę
MS
Mass Spectrometry
Spektrometria mas
m/z
mass-to-charge ratio
Stosunek masy do ładunku
MSP
Methylation Specific PCR
Metylo-specyficzny PCR
NMIBC
Non-Muscle Invasive Bladder Cancer
Rak pęcherza moczowego nie naciekający
mięśniówkę
NC
Normal Control
Próbka kontrolna (tkanka, mocz lub surowica)
OPLS-DA
Orthogonal Partial Least Squares Discriminant
Analysis
Ortogonalna analiza dyskryminacyjna
częściowych najmniejszych kwadratów
PCA
Principal Component Analysis
Analiza głównych składowych
PCR
Polymerase Chain Reaction
Reakcja łańcuchowa polimerazy
PLS-DA
Partial Least Squares Discriminant Analysis
Częściowa analiza dyskryminacyjna metodą
najmniejszych kwadratów
ROC
Curve
Receiver Operating Characteristic Curve
Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika
3
RP-HPLC
Reversed Phase High-Performance Liquid
Chromatography
Wysokosprawna chromatografia cieczowa w
odwróconym układzie faz
RPLC
Reversed Phase Liquid Chromatography
Chromatografia cieczowa odwróconej fazy
RT-PCR
Real-Time Polymerase Chain Reaction
Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie
rzeczywistym
SCC
Squamous Cell Carcinoma
Rak płaskonabłonkowy
SMPDB
The Small Molecule Pathway Database
Baza danych ścieżek małych cząsteczek
TOF
Time-Of-Flight
Analizator czasu przelotu
TRAP
Telomeric Repeat Amplification Protocol
Protokół powielania powtórzeń telomerowych
UC
Urothelial Carcinoma
Rak urotelialny
VIP
Variable Importance in Projection
Wpływ zmiennej na projekcję
4
Wykaz publikacji stanowiących podstawę
postępowania w sprawie o nadanie stopnia
naukowego doktora nauk medycznych
1. Ossoliński, K., Ruman, T., Ossoliński, T., Ossolińska, A., Arendowski, A., Kołodziej,
A., Płaza-Altamer, A., & Nizioł, J. (2023, March). Monoisotopic silver
nanoparticles-based mass spectrometry imaging of human bladder cancer tissue:
Biomarker discovery. Advances in Medical Sciences,68(1), 38–45.
https://doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002 IF = 3.287, punkty MNISW = 100
2. Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński,
T., & Ruman, T. (2022, September 7). Untargeted ultra-high-resolution mass
spectrometry metabolomic profiling of blood serum in bladder cancer. Scientific
Reports,12(1). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9 IF = 4.997, punkty
MNISW = 140
3. Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Nogueira, L. B., Nogueira, K. O.,
Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., & Nizioł, J. (2022,
December). Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer.
Journal of Pharmaceutical Analysis,12(6), 889–900.
https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004 IF = 14.026, punkty MNISW = 140
4. Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A.,
Ossolińska, A., Ossoliński, T., Nieczaj, A., & Nizioł, J. (2023, September). Targeted
and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis,233, 115473.
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115473 IF = 3.571, punkty MNISW = 100
5. Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński,
T., Nieczaj, A., & Ruman, T. (2023, June 16). Untargeted urinary metabolomics for
bladder cancer biomarker screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry.
Scientific Reports,13(1). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y IF = 4.997,
punkty MNISW = 140
5
Aktywność naukowa
Studia medyczne na kierunku lekarskim ukończyłem w 2013 roku. na Warszawskim
Uniwersytecie Medycznym, gdzie podczas studiów stacjonarnych zdobyłem tytuł lekarza.
W trakcie nauki zyskałemniezwykłą możliwość odbycia staży w renomowanych klinikach
urologicznych za granicą. We wrześniu 2010 roku miałem przyjemność odbyć staż w Klinice
Urologii Uniwersytetu Maksymiliana w Monachium. Rok później, we wrześniu 2011, odbyłem
staż w Klinice Urologii Uniwersytetu Wiedeńskiego. W sierpniu i wrześniu 2012 roku miałem
okazję odbyć trzeci staż, ponownie w Klinice Urologii Uniwersytetu Maksymiliana w
Monachium
Po zakończeniu studiów medycznych rozpocząłem pracę jako lekarz stażysta w
Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym w Warszawie, gdzie pracowałem
od października 2013 do października 2014 roku. Następnie kontynuowałem swoją karierę
jako lekarz rezydent urologii w Szpitalu Miejskim im. Jana Pawła II, w Klinicznym Oddziale
Urologii i Urologii Onkologicznej w Rzeszowie, od lutego 2015 do lipca 2018 roku.
Kolejnym etapem mojej pracy było stanowisko lekarza rezydenta urologii w SP ZOZ,
Szpitalu im. Jana Pawła II w Kolbuszowej, na Oddziale Urologii Ogólnej i Onkologicznej,
gdzie pracuję do dziś.
Od 2015 roku jestem członkiem Polskiego, Europejskiego i Amerykańskiego Towarzystwa
Urologicznego. To ważne dla mnie, aby być częścią społeczności naukowej i mieć
możliwość wymiany wiedzy z innymi specjalistami z tej dziedziny.
W mojej karierze naukowej miałem również okazję uczestniczyć w badaniach naukowych.
Od 2015 roku przy współpracy z Wydziałem Chemicznym Politechniki Rzeszowskiej zajmuję
się badaniami nad biomarkerami metabolicznymi nowotworów układu moczowego.
W badaniach biorą również udział naukowcy z Montana State University i Oklahoma
University w Stanach Zjednoczonych oraz Federal University of Ouro Preto w Brazylii, gdzie
prowadzone są pomiary z zastosowaniem NMR i ICP-OES.
Jestem współwykonawcą poniższych grantów naukowych finansowanych przez Ministerstwo
Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz Narodowe Centrum Nauki, dotyczących metod
poszukiwania biomarkerów raka nerki i raka pęcherza moczowego:
- “Poszukiwanie niskocząsteczkowych biomarkerów nowotworu nerki w osoczu krwi i
w moczu z wykorzystaniem techniki AuNPET LDI MS” finansowanego przez
Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego - Diamentowy Grant nr.
0184/DIA/2016/45
- "Metody LDI MS oraz MSI w poszukiwaniu biomarkerów raka nerki" finansowanego
przez Narodowe Centrum Nauki - OPUS 12, nr UMO-2016/23/B/ST4/00062
- “Poszukiwanie oraz charakterystyka biomarkerów raka pęcherza.” finansowanego
przez Narodowe Centrum Nauki - SONATA 14, nr UMO-2018/31/D/ST4/00109
Jestem autorem i współautorem 24 publikacji naukowych z dziedziny urologii cytowanych
łącznie 270 razy. Mój h-index (indeks Hirscha) wynosi 10 (źródło: www.googlescholar.com) a
6
sumaryczny impact factor wynosi 87.53 zaś sumaryczny impact factor publikacji będących
przedmiotem pracy doktorskiej wynosi 30.878.
Posługuję się zarówno językiem angielskim jak i niemieckim co potwierdzają uzyskane
certyfikaty językowe: First Certificate in English (B2), Certificate in Advanced English (C1)
oraz Zertifikat Deutsch (B1). Moje zaangażowanie w rozwój nauki w dziedzinie urologii nie
ogranicza się tylko do pracy badawczej. Biorę również udział w licznych szkoleniach i
konferencjach w kraju i za granicą. Uważam, że ciągłe doskonalenie i nauka są kluczowe dla
zawodowego rozwoju.
7
Dorobek publikacyjny
2012
Ossoliński K,. Leczenie kolki nerkowej oraz leczenie ułatwiające wydalenie złogu. Przegląd
Urologiczny. 2012/6 (76)
Ossoliński, K; Peller, M; Gilarowska, A; Dybowski, B; Radziszewski, P; Borkowski, A; Total
survival after radical cystectomy in patients with urothelial bladder cancer. European Urology
Supplements,4,11,91,2012,
2015
Dybowski B, Ossoliński K, Ossolińska A, Peller M, Bres-Niewada E, Radziszewski P. Impact
of stage and comorbidities on five-year survival after radical cystectomy in Poland: single
centre experience. Cent European J Urol. 2015;68(3):278-83.
2016
Nizioł J, Ossoliński K, Ossoliński T, Ossolińska A, Bonifay V, Sekuła J, Dobrowolski Z,
Sunner J, Beech I, Ruman T. Surface-Transfer Mass Spectrometry Imaging of Renal Tissue
on Gold Nanoparticle Enhanced Target. Anal Chem. 2016 Jul 19;88(14):7365-71. IF = 8.008
Peller M, Balsam P, Główczyńska R, Ossoliński K, Gilarowska A, Kołtowski Ł, Grabowski M,
Filipiak KJ, Opolski G. The impact of physical training on endothelial function in myocardial
infarction survivors: pilot study. Kardiol Pol. 2016;74(5):439-46. IF = 3.71
2017
Hus K.K., Ossoliński K., Jaromin M.,Ossoliński T., Ossolińska A., Dobrowolski Z.,Groszek
G., Bocian A., Łyskowski A. Comparison of protein isolation methods from clear cell Renal
Cell Carcinoma tissue. MicroMed. 2017; 5(1): 12- 16.
2018
Nizioł J, Bonifay V, Ossoliński K, Ossoliński T, Ossolińska A, Sunner J, Beech I, Arendowski
A, Ruman T. Metabolomic study of human tissue and urine in clear cell renal carcinoma by
LC-HRMS and PLS-DA. Anal Bioanal Chem. 2018 Jun;410(16):3859-3869. IF = 4.478
Arendowski A, Nizioł J, Ossoliński K, Ossolińska A, Ossoliński T, Dobrowolski
Z, Ruman T. Laser desorption/ionization MS imaging of cancer kidney tissue on silver
nanoparticle-enhanced target. Bioanalysis. 2018 Jan;10(2):83-94. IF = 2.695
Wiechno P., Kucharz J., Sadowska M., Michalski W., Sikora-Kupis B., Jonska-Gmyrek J.,
Poniatowska G., Nietupski K., Ossolinski K., Demkow T. Contemporary treatment of
metastatic renal cell carcinoma. Med Oncol. 2018;35(12):156. IF = 3.738
2019
Ossoliński K., Nizioł J., Arendowski A., Ossolińska A., Ossoliński T., Kucharz J., Wiechno P.,
Ruman T., Mass spectrometry-based metabolomic profiling of prostate cancer - a pilot study.
Journal of Cancer Metastasis and Treatment. 2019;5:1 IF = 1.9
8
2020
Nizioł J., Sunner J., Beech I., Ossoliński K., Ossolińska A., Ossoliński T., Płaza A., Ruman
T., Localization of Metabolites of Human Kidney Tissue with Infrared Laser-Based Selected
Reaction Monitoring Mass Spectrometry Imaging and Silver-109 Nanoparticle-Based
Surface Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Anal Chem. 2020
Mar 17;92(6):4251-4258. IF = 8.008
Nizioł J, Ossoliński K, Tripet BP, Copié V, Arendowski A, Ruman T. Nuclear magnetic
resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based serum
metabolomics of kidney cancer. Anal Bioanal Chem. 2020;412(23):5827-5841.
doi:10.1007/s00216-020-02807-1. IF = 4.478
Arendowski A, Ossolinski K, Niziol J, Ruman T. Screening of urinary renal cancer metabolic
biomarkers with gold nanoparticles - assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.
Anal Sci. 2020;10.2116/analsci.20P226. doi:10.2116/analsci.20P226. IF = 1.967
Wincewicz A, Hińcza K, Ossoliński K, et al. Evaluation of two different mutations in codon 12
of NRAS gene in ulcerated penile mucosal nodular malignant melanoma pT4b of the
90-year-old man in perspective of targeted therapy of NRAS-mutated advanced melanomas.
Dermatol Ther. 2020;e14115. doi:10.1111/dth.14115. IF = 3.858
Arendowski, Adrian, Krzysztof Ossoliński, Joanna Nizioł, and Tomasz Ruman. “Gold
Nanostructures - Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for Kidney
Cancer Blood Serum Biomarker Screening.” International Journal of Mass Spectrometry.
Elsevier, July 27, 2020. IF = 1.934
Kowalik A, Wincewicz A, Ossoliński K, Zięba S, Kopczyński J, Ossoliński T, Góźdź S, Koda
M, Sulkowski S. Review on significance of GDNF, PTCH1 and RNF213 in chromophobe
renal cell carcinoma illustrated by the case of 71-years-old man. Pol J Pathol.
2020;71(3):195-199. IF = 0.909
2021
Nizioł J, Ossoliński K, Tripet BP, Copié V, Arendowski A, Ruman T. Nuclear magnetic
resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based
metabolome profiling of urine samples from kidney cancer patients. J Pharm Biomed Anal.
2021 Jan 30;193:113752. doi: 10.1016/j.jpba.2020.113752. Epub 2020 Nov 6. PMID:
33197834. IF = 3.571
Arendowski A, Ossoliński K, Ossolińska A, Ossoliński T, Nizioł J, Ruman T. Serum and urine
analysis with gold nanoparticle-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry for
renal cell carcinoma metabolic biomarkers discovery. Adv Med Sci. 2021 Sep;66(2):326-335.
doi: 10.1016/j.advms.2021.07.003. Epub 2021 Jul 14. PMID: 34273747. IF = 2.852
Nizioł J, Copié V, Tripet BP, Nogueira LB, Nogueira KOPC, Ossoliński K, Arendowski A,
Ruman T. Metabolomic and elemental profiling of human tissue in kidney cancer.
Metabolomics. 2021 Mar 4;17(3):30. doi: 10.1007/s11306-021-01779-2. PMID: 33661419;
PMCID: PMC7932981. IF = 4.747
9
2022
Ossoliński, K., Ruman, T., Ossoliński, T., Ossolińska, A., Arendowski, A., Kołodziej, A.,
Płaza-Altamer, A., & Nizioł, J. (2023, March). Monoisotopic silver nanoparticles-based mass
spectrometry imaging of human bladder cancer tissue: Biomarker discovery. Advances in
Medical Sciences,68(1), 38–45. https://doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002 IF = 2.852
Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Nogueira, L. B., Nogueira, K. O., Kołodziej,
A., Płaza-Altamer, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., & Nizioł, J. (2022, December).
Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical Analysis,12(6), 889–900. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004
IF = 14.26
Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T., &
Ruman, T. (2022, September 7). Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry
metabolomic profiling of blood serum in bladder cancer. Scientific Reports,12(1).
https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9 IF = 4.997
2023
Nizioł, J., Ossoliński, K., Płaza-Altamer, A., Kołodziej, A., Ossolińska, A., Ossoliński, T.,
Nieczaj, A., & Ruman, T. (2023, June 16). Untargeted urinary metabolomics for bladder
cancer biomarker screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry. Scientific Reports,
13(1). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y IF = 4.997
Ossoliński, K., Ruman, T., Copié, V., Tripet, B. P., Kołodziej, A., Płaza-Altamer, A.,
Ossolińska, A., Ossoliński, T., Nieczaj, A., & Nizioł, J. (2023, September). Targeted and
untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis,233, 115473. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115473 IF = 3.571
10
Rozdział 1: Wprowadzenie
1.1 Rak pęcherza moczowego: epidemiologia, czynniki ryzyka, histopatologia i
aktualne metody diagnostyczne
1.1.1 Epidemiologia raka pęcherza moczowego
Rak pęcherza moczowego (BC) jest drugą po raku prostaty najczęstszą chorobą
nowotworową układu moczowego uwzględniając zarówno zapadalność jak i chorobowość.
W 2018 roku zdiagnozowano 550 000 nowych przypadków raka pęcherza moczowego na
świecie. Pod względem zapadalności jest szóstym najczęstszym nowotworem u mężczyzn,
siedemnastym u kobiet oraz dziesiątą co do częstości chorobą nowotworową uwzględniając
obie płcie. Standaryzowany wiekowo współczynnik zachorowalności na tę chorobę na
świecie wynosi 9.6 na 100 000 dla mężczyzn i 2.4 na 100 000 dla kobiet. W 2018 roku z
powodu raka pęcherza moczowego zmarło 200 000 osób, co uplasowało go na trzynastym
miejscu pod względem śmiertelności spowodowanej chorobami nowotworowymi na świecie i
na drugim miejscu (po raku prostaty) pod względem śmiertelności spowodowanej
nowotworami układu moczowego. Standaryzowany wiekowo współczynnik śmiertelności
wynosi 3.2 na 100 000 dla mężczyzn i 0.9 na 100 000 dla kobiet. W porównaniu z 2008
rokiem zapadalność na raka pęcherza wzrosła z 5.3 na 100 000 ludności do 5.7 na 100 000
ludności, zaś śmiertelność spadła z 2 na 100 000 ludności do 1.9 na 100 000 ludności [1,2].
1.1.2 Czynniki ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego
1.1.2.1 Wiek, płeć, rasa,
Według danych American Cancer Society mężczyźni są 3-4 razy bardziej narażeni na
rozwój raka pęcherza moczowego niż kobiety, prawdopodobnie z powodu zwiększonego
odsetka palaczy tytoniu oraz narażenia na działanie toksyn środowiskowych. W swoim życiu
mężczyźni mają 3.8% szansy na rozwój raka pęcherza moczowego i jest to 3-krotnie
większe prawdopodobieństwo niż w przypadku kobiet. Zapadalność osób z białym kolorem
skóry jest 2-krotnie wyższa niż w przypadku Afroamerykanów i Azjatów. Najwyższa
śmiertelność spowodowana rakiem pęcherza moczowego dotyczy białych mężczyzn.
Średnio mężczyźni mają 3-krotnie większą śmiertelność niż kobiety a osoby z białym
kolorem skóry 1.5 raza większą w porównaniu z Afroamerykanami i 3 razy większą w
porównaniu z Azjatami.
Wiek również w istotnym stopniu wpływa na prawdopodobieństwo zachorowania na raka
pęcherza moczowego. Osoby obu płci z przedziału 0-49 lat mają 0.1% ryzyka zachorowania,
50-59 lat - 0.2%, 60-69 lat - 0.5%, ponad 70 lat - 2.2%. W przeciwieństwie do wielu innych
nowotworów u osób młodszych (poniżej 40 roku życia) występuje tendencja do rozwoju
mniej agresywnego raka pęcherza moczowego [3,4].
1.1.2.2 Czynniki genetyczne
Obserwuje się 2-krotne zwiększone ryzyko rozwoju choroby u krewnych pierwszego stopnia
chorych na raka pęcherza moczowego. Uważa się, że w przeciwieństwie do postaci
dziedzicznych nowotworów, rak pęcherza moczowego jest wielogenową chorobą
11
nowotworową spowodowaną wieloma genami o niskiej penetracji bez wyraźnych cech
dziedziczenia mendlowskiego [5].
1.1.2.3 Palenie tytoniu
Palenie tytoniu jest najważniejszym czynnikiem ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego i
szacuje się, że odpowiada za 50 % jego wszystkich przypadków. Dym tytoniowy zawiera
ponad 60 różnych substancji rakotwórczych i uważa się, że palenie ma związek z
powstawaniem co najmniej 18 różnych nowotworów. Związki tj. aromatyczne aminy
(β-naftyloamina) oraz policykliczne aromatyczne węglowodory wydalane są przez nerki i
wywierają kancerogenny wpływ na cały układ moczowy. Ryzyko rozwoju raka pęcherza
moczowego u palaczy jest 2-4 krotnie większe niż u nie-palaczy a intensywność i czas
trwania palenia są wprost proporcjonalne do wzrostu ryzyka. Co istotne ryzyko rozwoju raka
pęcherza moczowego zmniejsza się z czasem od momentu rzucenia nałogu jednak nie
osiąga poziomu populacyjnego. Szacuje się, że nawet 20 lat po rzuceniu nałogu ryzyko
nadal jest 2-krotnie większe. Palenie wpływa również na częstość nawrotów oraz ryzyko
progresji do raka pęcherza naciekającego mięśniówkę [6,7].
1.1.2.4 Narażenie zawodowe
Zawodowe narażenie na kancerogeny, po paleniu tytoniu, uznawane jest za drugi
najważniejszy czynnik etiologiczny powstawania raka pęcherza moczowego. Około 20%
przypadków związane jest z narażeniem na takie czynniki jak aminy aromatyczne,
policykliczne aromatyczne węglowodory, węglowodory chlorowane, które powstają w
przemyśle barwiarskim, gumowym, metalowym, petrochemicznym i rafineryjnym [6]. Uważa
się, że istnieje długi okres karencji wynoszący 10-20 lat pomiędzy narażeniem na
kancerogeny przemysłowe a powstaniem raka pęcherza moczowego [6,8].
1.1.2.6 Zapalenie pęcherza moczowego
Najbardziej wyraźny związek pomiędzy przewlekłym zapaleniem pęcherza moczowego a
ryzykiem rozwoju raka obserwuje się w wyniku zakażenia Schistosoma haematobium i
Schistosoma mansoni. Endemicznym miejscem występowanie tych przywr jest Egip. W
latach 60 XX wieku ogólna częstość występowania infekcji wynosiła 40% i zmniejszyła się w
2010 roku do poziomu <0.3% w efekcie rządowej kampanii antybilharzialnej [9]. Mechanizm
kancerogenezy w przypadku zakażenia przywrami nie jest całkowicie poznany. Podejrzewa
się, że główną rolę odgrywają przewlekły proces zapalny i narażenie na działanie czynników
środowiskowych, które mogą generować genotoksyczne substancje w moczu tj.
nitrozoaminy. Substancje te są wytwarzane w bardzo wysokiej ilości w moczu pacjentów
przewlekle zakażonych Schistosomą i są znanym rakotwórczym czynnikiem rozwoju raka
pęcherza moczowego.
1.1.3 Histopatologia nowotworów pęcherza moczowego
Prawidłowa budowa pęcherza moczowego składa się z czterech warstw: błony śluzowej,
błony podśluzowej, warstwy mięśniowej oraz warstwy surowiczej. Błona śluzowa wyłożona
jest przez wyspecjalizowany nabłonek przejściowy zwany urotelium. Jest on wynikiem
adaptacji do drażniącego środowiska jakim jest mocz. Składa się z 3-6 warstw komórek.
12
Istnieją dwa podtypy komórek nabłonka urotelialnego: komórki baldaszkowate, które
pokrywają powierzchnię i mają bezpośredni kontakt z moczem oraz komórki leżące u ich
podstaw, które stanowią zewnętrzną warstwę. Szczytowa błona komórkowa komórek
baldaszkowatych składa się z białkowych płytek zbudowanych z uroplakiny, połączonych
zawiasowymi obszarami normalnej błony. Tworzy ona nieprzepuszczalną dla wody i jonów
barierę osmotyczną. Warstwa podstawna urotelium opiera się na błonie podstawnej. Pod
błoną podstawną znajduje się blaszka właściwa (lamina propria) błony śluzowej. Jest to
luźna strefa składająca się z tkanki łącznej, zawierającej cienkie i delikatne naczynia
krwionośne oraz wiązki gładkich włókien mięśniowych, zwanych warstwą mięśniową
śluzówki (muscularis mucosae). Jest mocno zróżnicowana, w niektórych miejscach składa
się z niekompletnej warstwy włókien mięśni gładkicg aż do pełnej warstwy podobnej do tej w
jelicie grubym. Tkanka łączna pod warstwą mięśniową śluzówki zawiera arkada większych
naczyń krwionośnych. Pod spodem znajduje się właściwa warstwa mięśniowa (muscularis
propria) składająca się z grubych wiązek włókien mięśniowych i niewielkiej ilości luźnej
tkanki łącznej [10].
Rak pęcherza moczowego jest nowotworem złośliwym rozwijającym się zwykle w błonie
śluzowej pęcherza moczowego. Najczęstsze typy histopatologiczne tego nowotworu to rak
urotelialny, rak płaskonabłonkowy i gruczolakorak.
Rak urotelialny
Rak urotelialny jest najczęstszym typem raka pęcherza moczowego - stanowi około 90%
wszystkich przypadków. Ten typ nowotworu powstaje z komórek urotelialnych
wyściełających wnętrze pęcherza moczowego. Głównym kryterium podziału nowotworów
pęcherza moczowego jest głębokość naciekania na ścianę pęcherza moczowego. 75%
przypadków stanowi tzw. rak pęcherza nienaciekający mięśniówki (non-muscle invasive
bladder cancer, NMIBC) i obejmuje błonę śluzową (Ta, CIS) oraz podśluzową (T1).
Pozostałe 25% stanowi rak pęcherza moczowego naciekający mięśniówkę (muscle invasive
bladder cancer, MIBC). Głębokość naciekania ściany pęcherza jest istotna klinicznie ze
względu na wybór metody leczenia oraz fakt, że pacjenci z MIBC znajdują się w grupie
najwyższego ryzyka śmiertelności spowodowanej nowotworami złośliwymi. Istnieje kilka
wzorców wzrostu raka urotelialnego w tym typ płaski, brodawkowaty (egzofityczny),
odwrócony (endofityczny) oraz lity, uszypułowany. NMIBC obejmuje zmiany takie jak rak
in-situ (Carcinoma in situ, CIS), brodawczakowaty nowotwór urotelialny o niskim potencjale
złośliwości (ang. Papillary Urothelial Neoplasm of Low Malignant Potential, PUNLMP),
niskiego stopnia złośliwości rak brodawczakowy (Low Grade Bladder Cancer, LG BC) oraz
wysokiego stopnia złośliwości rak brodawczakowy (High Grade Bladder Cancer, HG BC)
[10,11,12].
Rak płaskonabłonkowy
Rak płaskonabłonkowy pęcherza moczowego jest rzadkim typem, stanowiącym około 1-2%
wszystkich nowotworów pęcherza moczowego w Stanach Zjednoczonych i Europie. W
Egipcie i Zimbabwe obserwuje się największy odetek płaskonabłonkowych raków pęcherza
moczowego na świecie. Wiąże się to z przewlekłym, endemicznym zapaleniem pęcherza
moczowego spowodowanym przez przywry z gatunku Schistosoma. Drugą populacją
szczególnie narażoną na zwiększone ryzyko raka płaskonabłonkowego pęcherza
13
moczowego są pacjenci po urazie kręgosłupa. Podejrzewa się, że jest to wywołane
drażnieniem ściany pęcherza moczowego poprzez przewlekłe cewnikowanie oraz
nawracające infekcje [14].
Gruczolakorak
Gruczolakorak to kolejny rzadki typ raka pęcherza moczowego, stanowiący około 1%
wszystkich przypadków. Ten typ wywodzi się z komórek gruczołowych pęcherza
moczowego. Wyróżnia się dwa rodzaje raków gruczołowych pęcherza moczowego -
wywodzące się z moczownika, pasmo tkanki łącznej będące pozostałością omoczni (⅓
przypadków), oraz pierwotne gruczolakoraki pęcherza moczowego (⅔ przypadków)
[15,16,17].
Rak drobnokomórkowy
Rak drobnokomórkowy pęcherza moczowego jest bardzo rzadką i agresywną formą raka
pęcherza moczowego, która stanowi mniej niż 1% wszystkich nowotworów pęcherza
moczowego. Jest to nowotwór neuroendokrynny, co oznacza, że zaczyna się w komórkach,
które uwalniają hormony w odpowiedzi na sygnały z układu nerwowego. Komórki raka
drobnokomórkowego są mniejsze niż większość innych komórek nowotworowych, a ten typ
raka jest zwykle bardzo agresywny i często w momencie diagnozy obecne są przerzuty [13].
Inne podtypy histopatologiczne
Istnieje kilka innych podtypów histopatologicznych raka pęcherza moczowego, ale są one
niezwykle rzadkie i z reguły bardzo agresywne. Należą do nich odmiany raka urotelialnego
takie jak: rak urotelialny z gniazdami (nested variant of urothelial carcinoma), rak urotelialny
mikrobrodawkowaty (micropapillary urothelial carcinoma) oraz rak plazmocytoidalny
(plasmocytoid urothelial carcinoma) [10,13]. Wyróżnia się również raki sarkomatoidalne,
limfoepitelialne, mięsaki i raki jasnokomórkowe [13]. W Tabeli 1 podsumowano wszystkie
postacie histopatologiczne nowotworów pęcherza moczowego.
1.1.4 Grading i staging raka pęcherza moczowego
Celem oceny stopnia zaawansowania raka pęcherza moczowego stosuje się pochodzącą z
2002 roku i zaktualizowaną w 2009 roku klasyfikację TNM. Do oceny zróżnicowania
histopatologicznego używa się klasyfikacji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) z 1973
roku lub zaktualizowanej wersji WHO i International Society of Urological Pathology (IUSP),
którą zaproponowano w 1998 roku i którą WHO przedstawiła w 2004 roku. Klasyfikacja ta
uwzględnia zarówno zmiany płaskie (hiperplazja, atypia reaktywna, atypia nieznanego
charakteru, dysplazja nabłonka urotelialnego i rak śródnabłonkowy CIS), jak i zmiany
brodawczakowate (brodawczak przejściowokomórkowy, brodawczakowy nowotwór nabłonka
o niskim potencjale złośliwości, niskiego stopnia złośliwości brodawczakowy rak nabłonka,
wysokiego stopnia złośliwości brodawczakowy rak nabłonka). Większość dotychczasowych
badań nad rakiem pęcherza moczowego została przeprowadzona z zastosowaniem
klasyfikacji WHO z 1973 roku, w związku z czym Europejskie Towarzystwo Urologiczne
(European Association of Urology - EAU) zaleca stosowanie obydwu klasyfikacji WHO do
czasu sprawdzenia prognostycznej roli klasyfikacji WHO z 2004 roku. W 2016 roku
14
opublikowano nową klasyfikację WHO nowotworów pęcherza moczowego z niewielkimi
zmianami w stosunku do klasyfikacji z 2004 roku [18]. Tabele 2 i 3 podsumowują grading i
staging raka pęcherza moczowego.
Tabela 1. Histopatologiczne postacie nowotworów pęcherza moczowego (WHO 2004).*
Nowotwór urotelialny
-Łagodny
Brodawczak urotelialny
Odwrócony brodawczak
- Brodawczakowy nowotwór urotelialny o niskim
potencjale złośliwości
- Brodawczak złośliwy
Rak brodawczakowy, niski potencjał złośliwości
Rak brodawczakowy, wysoki potencjał złośliwości
Rak brodawczakowy z różnicowaniem
płaskonabłonkowym lub gruczołowym
- Złośliwy, nie-brodawczakowy
Płaski rak in situ
Rak naciekający
Odmiany raka naciekającego
Z gniazdami
Drobnokanalikowy
Mikrotorbielowaty
Odwrócony
Z różnicowaniem płaskonabłonkowym
Z różnicowaniem gruczołowym
Mikrobrodawkowaty
Rak mięsakowaty
Rak jasnokomórkowy
Plazmocytoidalny
Z syncytiotrofoblastem
Z nietypowym odczynem zrębu
Zrąb pseudomięsakowaty
Zrąb kostny lub metaplazja chrzęstnokomórkowa
Rak olbrzymiokomórkowy, typ osteoklastyczny
Z zaznaczonym naciekiem limfoidalnym
Rak płaskonabłonkowy
Typ zwykły
Odmiana
Brodawkowaty
Bazaloidalny
Z cechami mięsaka
Gruczolakorak
Typ jelitowy
Śluzowy
Z komórek sygnetowatych
Jasnokomórkowy
Rak hepatoidalny
Gruczolakorak, niesklasyfikowany inaczej
Guz składający się z mieszanych komórek
Raki niezróżnicowane
Rak drobnokomórkowy
Rak wielkokomórkowy, neuroendokrynny
Rak typu nabłoniaka limfatycznego
Rak olbrzymiokomórkowy
Raki niezróżnicowane
Przerzut
*Opracowano na podstawie: Lopez-Beltran A. Bladder cancer: clinical and pathological profile. Scand J Urol
Nephrol Suppl 2008;218:95–109.
15
Tabela 3. Klasyfikacja TNM raka pęcherza moczowego*.
T - Guz pierwotny
TX
Brak możliwości oceny guza pierwotnego
T0
Brak guza pierwotnego
Ta
Nienaciekający rak brodawczakowaty
Tis
Rak śródnabłonkowy (in situ)
T1
Guz nacieka podnabłonkową tkankę łączną
T2
T2a
Guz nacieka połowę wewnętrznej warstwy mięśniowej
T2b
Guz nacieka całą mięśniówkę
T3
T3a
Guz nacieka mikroskopowo tkankę okołopęcherzową
T3b
Guz nacieka makroskopowo tkankę okołopęcherzową
T4
T4a
Guz nacieka stercz, macicę i pochwę
T4b
Guz nacieka ścianę miednicy lub powłoki brzuszne
N - Węzły chłonne
NX
Brak możliwości oceny regionalnych węzłów chłonnych
N0
Brak przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych
N1
Przerzut do pojedynczego węzła chłonnego w obrębie miednicy właściwej
N2
Przerzut do wielu węzłów chłonnych w obrębie miednicy właściwej
N3
Przerzut do jednego lub wielu węzłów chłonnych biodrowych wspólnych
M - Przerzuty
MX
Brak możliwości ocen odległego przerzutu
M0
Brak przerzutów odległych
M1
Przerzuty odległe
*Opracowano na podstawie wytycznych postępowania dotyczących raka pęcherza moczowego Europejskiego
Towarzystwa Urologicznego, tłumaczenie Polskiego Towarzystwa Urologicznego.
16
1.1.5 Diagnostyka raka pęcherza moczowego
Najczęstszym objawem raka pęcherza moczowego jest krwiomocz i występuje on u 85%
pacjentów z nowo rozpoznanym guzem pęcherza moczowego. Bezobjawowy krwinkomocz
pojawia się niemal u wszystkich pacjentów. Definiowany jest przez Amerykańskie
Towarzystwo Urologiczne (AUA) jako obecność ⋝3 erytrocytów w mikroskopowej ocenie
osadu moczu w dwóch z trzech prawidłowo pobranych próbek moczu. Ocenia się, że niesie
ze sobą 5,4% ryzyka obecności nowotworu układu moczowego i 4,1% ryzyka obecności
guza pęcherza moczowego [19]. Z tego względu AUA zaleca pełne badanie jak w przypadku
krwiomoczu z uwzględnieniem tomografii komputerowej, cystoskopii i badania
cytologicznego moczu [20]. Nowotwory pęcherza moczowego zwykle nie powodują bólu
oraz rzadko współwystępują z objawami pochodzącymi z dolnych części układu
moczowego. Wyjątkiem jest CIS, który może dawać podrażnieniowe objawy ze strony
dolnych dróg moczowych, tj. parcia naglące i częstomocz.
Każda diagnostyka krwiomoczu powinna obejmować sumiennie zebrany wywiad dotyczący
czynników ryzyka raka pęcherza moczowego, w tym palenia tytoniu, informacji na temat
miesiączki, obecności dodatkowych objawów, tj. bólu czy pieczenia przy oddawaniu moczu
oraz informacji na temat niedawno przebytych zabiegów urologicznych i ginekologicznych.
Celem wstępnej oceny pacjenta z krwiomoczem wykorzystuje się przezbrzuszne badanie
ultrasonograficzne. Pozwala ono na wykrycie zmian ogniskowych w nerkach, wpuklający się
do światła pęcherza moczowego guzów oraz wodonercza jako objawu pośredniego w
niektórych nowotworach układu moczowego. Ograniczenia diagnostyki przy użyciu
ultrasonografu wynikają z braku możliwości wykluczenia raka urotelialnego górnych dróg
moczowych. Pełna diagnostyka krwiomoczu powinna obejmować wziernikowanie pęcherza
moczowego (cystoskopia), badanie cytologiczne moczu oraz badanie obrazowe górnych i
dolnych dróg moczowych (urograficzną tomografię komputerową jamy brzusznej i miednicy).
Badanie obrazowe wykonuje się głównie w celu wykrycia nowotworów urotelialnych górnego
odcinka dróg moczowych (upper tract urothelial carcinoma, UTUC).
Podstawowym badaniem diagnostycznym w przypadku podejrzenia raka pęcherza
moczowego jest cystoskopia. Pozwala ona na uwidocznienie zmiany i pobranie wycinka do
badania histopatologicznego. Zwykle wykonywana jest w warunkach ambulatoryjnych przy
użyciu sztywnego albo coraz częściej giętkiego cystoskopu. Badanie cystoskopowe
uzależnione jest w dużym stopniu od doświadczenia lekarza przeprowadzającego badanie
oraz jakości użytego sprzętu. Ocenia się, że 4-27% guzów zostaje pominiętych przy
badaniu. Wartość ta wzrasta do 32-77% w przypadku zmian o charakterze CIS [21].
Wraz z postępem technologii i lepszym zrozumieniem zmian metabolicznych zachodzących
w nowotworach pęcherza moczowego wprowadzono kilka modyfikacji badania
cystoskopowego, które zwiększają jego czułość. Przykładem jest tzw. cystoskopia
fluorescencyjna/diagnostyka fotodynamiczna (photodynamic diagnosis, PDD). Metoda ta jest
praktycznym przykładem na to, jak zmieniony metabolizm komórek nowotworowych może
przyczyniać się do poprawy diagnostyki i leczenia nowotworu.
17
Polega na wykorzystaniu w badaniu cystoskopowym światła niebieskiego po uprzednim
wykonaniu wlewki dopęcherzowej ze środkiem fotouczulającym takim jak kwas
5-aminolewulinowy (5-ALA) lub kwas heksaminolewulinowego (HAL). Wszystkie komórki
nabłonka urotelialnego go pochłaniają, jest on jednak nadmiernie gromadzony przez szybko
dzielące się komórki nowotworowe (10-krotnie wyższy poziom). Badania wykazały, że
wskaźnik wykrywalności guza pęcherza moczowego wynosi 73-96% w przypadku
cystoskopii w białym świetle w porównaniu z 90-96% w przypadku cystoskopii
fluorescencyjnej. PDD jest szczególnie pomocne w wykrywaniu CIS -wskaźniki
wykrywalności wynoszą 23-68% w przypadku cystoskopii w białym świetle w porównaniu z
91-97% w przypadku cystoskopii fluorescencyjnej [22,23].
1.1.6 Markery nowotworowe raka pęcherza moczowego
1.1.6.1 Wstęp
Obecne narzędzia diagnostyczne i prognostyczne stosowane w diagnostyce raka pęcherza
moczowego, takie jak cystoskopia i cytologia, mają ograniczenia w zakresie czułości i
swoistości. Markery nowotworowe mogłyby stanowić alternatywę dla tego inwazyjnego i
kosztownego badania.
Wczesna diagnoza i dokładnie określenie stopnia zaawansowania klinicznego i złośliwości
histopatologicznej są kluczowe dla skutecznego leczenia i poprawy wskaźników przeżycia
każdego nowotworu w tym raka pęcherza moczowego. Jednym z obiecujących podejść do
osiągnięcia tych celów jest identyfikacja i charakterystyka biomarkerów, które są mierzalnymi
wskaźnikami procesów biologicznych związanych z chorobą. Biomarkery mogą dostarczyć
ważnych informacji na temat mechanizmów rozwoju i progresji raka pęcherza moczowego, a
także służyć jako narzędzia diagnostyczne i prognostyczne. Ich znaczenie obejmuje
wczesne wykrywanie, gdzie mogą być używane jako nieinwazyjne narzędzia pomagające w
identyfikacji raka pęcherza moczowego, nawet zanim pojawią się objawy lub staną się one
widoczne w badaniach obrazowych. Wczesne wykrycie może znacznie poprawić wyniki
leczenia pacjentów. Co więcej, biomarkery związane z agresywnymi formami raka pęcherza
moczowego mogą pomóc klinicystom w stratyfikacji pacjentów na podstawie ich ryzyka,
oferując spersonalizowane opcje leczenia. Biomarkery można również wykorzystywać w
celu monitorowania skuteczności terapeutycznej i wykrywania wczesnych oznak nawrotu, co
ma zastosowanie w nowotworach dróg moczowych, tj. raku prostaty czy rak jądra. Biorąc
pod uwagę wysoki wskaźnik nawrotów raka pęcherza moczowego, ma to kluczowe
znaczenie.
W erze medycyny spersonalizowanej biomarkery są kluczowe do podejmowania decyzji o
wyborze odpowiedniej terapii celowanej. Wraz z głębszym zrozumieniem raka pęcherza
moczowego na poziomie molekularnym, pojawiają się terapie ukierunkowane na określone
mutacje genetyczne lub nieprawidłowości molekularne związane z rakiem pęcherza
moczowego. Przykładem może być ekspresja ligandu programowanej śmierci 1 (PD-L1) ,
którego ekspresja pozwala na dobór leczenia w przerzutowym raku pęcherza moczowego.
W przypadku raka pęcherza moczowego zastosowanie biomarkerów może umożliwić
wczesne wykrywanie, stratyfikację ryzyka, monitorowanie leczenia i personalizację terapii,
prowadząc do poprawy wyników leczenia pacjentów.
18
Dobry marker nowotworowy powinien charakteryzować się małą inwazyjnością sposobu
jego pobierania (najlepiej z moczu lub surowicy), powinien być szybki i łatwy do oznaczenia
obiektywny do oceny i interpretacji, o wysokiej czułość i swoistości. Marker raka pęcherza
moczowego byłyby użyteczny zarówno do badań przesiewowych, jako element diagnostyki
pacjentów z krwiomoczem lub innymi objawami sugerującymi raka pęcherza moczowego
jak i w celu obserwacji pacjentów z rakiem pęcherza moczowego celem wczesnej
identyfikacji nawrotów i zapobieganiu progresji choroby. Ze względu na stosunkowo niską
zapadalność na raka pęcherza moczowego, badanie przesiewowe całej populacji nie byłoby
opłacalne ekonomicznie [24]. Jednakże screening osób narażonych na znane czynniki
rakotwórcze tj. palaczy, pracowników przemysłu barwiarskiego, gumowego, metalowego,
petrochemicznego i rafineryjnego oraz osób po radioterapii w obrębie miednicy może być
korzystyny dla wczesnego wykrywania raka pęcherza moczowego. Taki biomarker miałby
również potencjał do zredukowania liczby lub poprawy jakości kontrolnych cystoskopii.
Lokeshwar i wsp. sprecyzowali dokładnie jakie cechy powinien mieć klinicznie użyteczny
marker raka pęcherza moczowego, powołując Międzynarodowy Panel Porozumienia ds.
Markerów Raka Pęcherza Moczowego (International Consensus Panel on Bladder Tumor
Markers) [25]. Po pierwsze idealny marker raka pęcherza moczowego powinien być
technicznie prosty do pobrania. Następnie powinien cechować się odpowiednią
dokładnością diagnostyczną, co jest określane za pomocą parametrów, takich jak: czułość,
swoistość, pole pod krzywą ROC (Area Under Curve, AUC), wartość predykcyjna dodatnia i
wartość predykcyjna ujemna. Ostatnim, ale nie mniej ważnym parametrem idealnego
markera raka pęcherza moczowego jest jego koszt.
Szacuje się, że pod względem kosztów leczenia i diagnostyki rak pęcherza moczowego
należy do najdroższych ze wszystkich nowotworów. Koszt leczenia od momentu diagnozy
do śmierci wynosi od 89 000 USD do nawet 202 000 USD. Cystoskopia w połączeniu z
badaniem cytologicznym jest podstawowym badaniem we wstępnej diagnostyce, a
następnie kontroli pacjenta po leczeniu. W Polsce badanie to wyceniane jest na kwotę około
200 euro zaś w Wielkiej Brytaniii to koszt nawet 600 euro [26]. W przypadku guzów o
wysokim ryzyku follow-up obejmuje kontrolną cystoskopię co 3 miesiące przez okres 2 lat, a
następnie co 6 miesięcy do zakończenia okresu 5-letniego, później raz w roku oraz
regularne (co roku) wykonywanie badań obrazowych górnych dróg moczowych (tomografia
komputerowa). Jest to więc duże obciążenie zarówno dla pacjenta jak i dla systemu opieki
zdrowotnej.
1.1.6.2 Cytologia moczu
Cytologia moczu jest pierwszym i szeroko dostępnym klinicznie markerem raka
urotelialnego. Została wprowadzona po raz pierwszy przez Papanicolaou w 1945 roku i
polega na poszukiwaniu złuszczonych komórek nowotworowych w moczu lub popłuczynach
z pęcherza moczowego. Czułość i swoistość tej metody wynosi odpowiednio 11-76% i
>90%. Oznacza to, że dodatni wynik jest niemal diagnostyczny dla nowotworu
nabłonkowego w obrębie układu moczowego. Nie wskazuje on jednak na miejsce rozwoju
nowotworu - rak może się znajdować zarówno w układzie kielichowo-miedniczkowym,
moczowodzie jak i pęcherzu moczowym. Z uwagi na niską czułość badania cytologicznego
moczu w pzypadku nowotworów o niskim stopniu złośliwości (4-31%) ujemny wynik nie
wyklucza obecności nowotworu w drogach moczowych. Wartość cytologii jest duża w
19
przypadku guzów o wysokim stopniu złośliwości i CIS, ponieważ dochodzi do utraty
spójności między komórkami nabłonka co prowadzi do złuszczania się dużej ilości komórek.
Na wynik badania cytologicznego moczu mają wpływ takie czynniki jak doświadczenie
oceniającego patologa, łagodne schorzenia w obrębie dróg moczowych, tj. zakażenie dróg
moczowych, kamica moczowa a także stan po leczeniu BCG [27].
1.1.6.3 Inne markery raka pęcherza moczowego
W celu zniwelowania ograniczeń aktualnych metod diagnostyki raka pęcherza moczowego
prowadzone są badania mające na celu wykrycie biomarkerów występujących w surowicy
lub moczu. Związki te mogą odzwierciedlać różne aspekty biologii raka pęcherza
moczowego, takie jak zmiany w ekspresji genów, metylacji DNA, ekspresji białek, szlaków
metabolicznych i mikrośrodowiska guza. W Tabeli 5 przedstawiono podsumowanie i
przegląd komercyjnie dostępnych markerów raka pęcherza moczowego. Żaden z tych
markerów nie został jednak zaakceptowany do rutynowej diagnostyki przez towarzystwa
urologiczne. Europejskie Towarzystwo Urologiczne wylicza ich główne cechy:
- czułość jest zwykle wyższa kosztem niższej swoistości w porównaniu z cytologią
moczu;
- łagodne schorzenia dróg moczowych, tj. infekcje, kamica moczowa i terapia BCG,
mogą wpływać na wyniki tych testów;
- niska powtarzalność niektórych testów może być wyjaśniona przez dobór pacjentów
oraz skomplikowanymi metodami laboratoryjnymi;
- dodatni wynik badań cytologicznych, UroVysion, NMP22, FGFR 3, TERT i analizy
mikrosatelitarnej u pacjentów z negatywnym wynikiem badania cystoskopowego i
badania obrazowego górnych dróg moczowych może zidentyfikować pacjentów z
większym prawdopodobieństwem nawrotu i progresji choroby nowotworowej;
- cztery z komercyjnie dostępnych biomarkerów z moczu: Cx-Bladder, ADX-Bladder,
Xpert Bladder i EpiCheck mają czułość i ujemne wartości predykcyjne porównywalne
z badaniem cystoskopowym. Te cztery testy mogą być wykorzystane do zastąpienia
i/lub odroczenia cystoskopii, ponieważ mogą zidentyfikować rzadkie nawroty raka
pęcherza moczowego nie-naciekającym mięśniówki o wysokim stopniu złośliwości
histopatologicznej.
20
Tabela 5. Komercyjnie dostępne markery nowotworowe raka pęcherza moczowego.
Rodzaj
Nośnik
Marker
Czułość
(%)
Swoistość
(%)
Wykrywany związek
Typ testu
Rejestracja
FDA
Dostępny w
Polsce?
białkowe
mocz
BTA-Stat
36-89
50-70
białko związane z czynnikiem H dopełniacza
test przyłóżkowy
follow-up
tak, 120zł
mocz
BTA-TRAK
57-83
~90
białko związane z czynnikiem H dopełniacza
sandwich ELISA
-
mocz
NMP-22
47-100
56
55-80
86
białko jądrowego aparatu mitotycznego
(NuMA)
sandwich ELISA
follow-up
-
mocz
test przyłóżkowy
diagnostyka
follow-up
tak, 130zł
mocz
BLCA-4
89-96
100
białko macierzy jądrowej
ELISA
-
-
mocz
Surwiwina
64-100
87-100
białko z rodziny inhibitorów apoptozy
immunoblotting przy użyciu
systemu mikrofiltracji BioDot
-
-
mocz
UBC
36-79
88-92
cytokeratyna 8 i 18
test przyłóżkowy
-
tak, 150zł
mocz
sandwich ELISA
-
-
mocz
CYFRA 21-1
75-97
67-71
cytokeratyna 19
test immunoradiometryczny
lub ELISA
-
tak, 50zł
oparte na badaniu
cytologicznym
mocz
Cytologia
11-76
>90
komórki nowotworowe
badanie mikroskopowe
nd.
tak, 100zł
mocz
DD23
73-100
33-67
antygen związany z nowotworem, 185-kDa
test immunocytochemiczny
-
-
mocz
Immunocyt/uCyt+
38-90
73-80
CEA, dwie mucyny związane z komórkami
nowotoworu pęcherza moczowego
test immunocytochemiczny
follow-up
-
genetyczne
mocz
UroVysion
68-87
>90
aneuploidia chromosomu 3,7,17
delecja locus 9p21
wielokolorowy FISH
diagnostyka
follow-up
tak, 1000zł
mocz
Telomeraza (TRAP)
70-90
60-70
aktywność enzymu - telomerazy
TRAP
-
-
mocz
CxBladder
82
85
5 fragmentów mRNA: MDK, HOXA13, CDC2,
IGFBP5, CXCR2
RT-PCR
-
-
mocz
AssureMDX
93-97%
83-86%
metylacja genów: OTX1, ONECUT2, TWIST1
mutacji genów: FGFR3, TERT, HRAS
MSP + sekwencjonowanie
nowej generacji
-
-
Inne markery, niedostępne komercyjnie.
genetyczne
mocz
Analiza mikrosatelitarna
72-97
>95
polimorfizm krótkich powtórzeń tandemowych
RT-PCR
-
-
mocz
Telomeraza (hTERT)
83-95
60-70
hTERT
RT-PCR
-
-
mocz
Cytokeratyna 20
82-87
55-70
mRNA cytokeratyny 20
RT-PCR
-
-
białkowe
mocz
HA-HAase
88-94
67-71
kwas hialuronowy i hialuronidaza
ELISA
-
-
1.2 Metabolomika: zastosowanie w badaniach nad nowotworami
Metabolomika jest dziedziną nauki zajmująca się badaniem procesów metabolicznych
zachodzących w organizmie poprzez analizę jakościową i ilościową małocząsteczkowych
związków, metabolitów i szlaków biologicznych w których występują. Metabolity zazwyczaj
są związkami chemicznymi o masie cząsteczkowej poniżej 1500 Da i należą do nich
węglowodany, lipidy, aminokwasy, kwasy tłuszczowe, kwasy organiczne, nukleotydy, sterydy,
alkaloidy, witaminy, fenole i wiele innych. Metabolomika, będąca końcowym produktem
procesów komórkowych, zapewnia funkcjonalny odczyt biochemii komórkowej i może
zaoferować nieoceniony wgląd w fizjologiczny i patologiczny stan organizmu. W kontekście
badań nad nowotworami - metabolomika stała się potężnym narzędziem do zrozumienia
złożonego biochemicznego krajobrazu komórek nowotworowych i ich mikrośrodowiska.
Profil metabolomiczny komórki nowotworowej odzwierciedla przeprogramowane szlaki
metaboliczne, które napędzają jej niekontrolowany wzrost, przetrwanie i inwazję, a profile te
mogą być wykorzystane do celów diagnostycznych, prognostycznych i terapeutycznych.
Metabolomika wraz z genomiką, transkryptomiką, proteomiką stanowią element tzw. biologii
systemowej, zajmującej się badaniem złożonych i skomplikowanych oddziaływań
zachodzących w systemach biologicznych (Schemat 1).
Schemat 1. Dziedziny biologii systemowej: genomika, transkryptomika, proteomika i
metabolomika
22
Metabolomika ma szereg teoretycznych przewag nad innymi dziedzinami badania biologii
systemów. Jest najszybszym systemem reakcji organizmu na bodźce i zmiany, co najlepiej
pozwala na ocenę jego aktualnego stanu. Profil metaboliczny można traktować jako
wypadkową reakcji organizmu na czynniki genetyczne, czynniki środowiskowe, aktywność
fizyczną, dietę, choroby i zastosowane leczenie. W przeciwieństwie do genów i białek,
których funkcje podlegają odpowiednio regulacji epigenetycznej i modyfikacjom
potranslacyjnym, metabolity są bezpośrednią sygnaturą aktywności biochemicznej
organizmu i są najdokładniejszą reprezentacją fenotypu. Dużą zaletą badań
metabolomicznych jest ich stosunkowo niski koszt i możliwość szybkiej analizy.
1.3 Metody analizy chemicznej stosowane w metabolomice
W badaniach metabolomicznych stosowane są głównie dwie podstawowe metody
analityczne: spektrometria mas (MS) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego
(NMR). Obie techniki mają swoje unikalne zalety i ograniczenia, które wpływają na ich
zastosowanie w konkretnych scenariuszach badawczych.
1.3.1 Spektrometria mas (MS)
Spektrometria mas to technika powszechnie stosowana w badaniach metabolomicznych z
racji na wysoką czułość, szeroki zakres dynamiczny oraz zdolność do analizy dużej liczby
metabolitów. W spektrometrii mas metabolity w próbce są jonizowane a następnie
rozdzielane na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z). Kolejno rozdzielone jony są
wykrywane, a powstałe widma masowe analizowane w celu ich identyfikacji i analizy
ilościowej.
W spektrometrach mas można wyróżnić kilka etapów analizy spektrometrycznej [32].
Pierwszym jest jonizacja gdzie cząsteczki próbki są przekształcane w naładowane
cząsteczki, czyli jony. Często stosowanymi metodami jonizacji są jonizacja w elektrospreju /
jonizacja przez elektrorozpylanie (ESI), desorpcja/jonizacja laserowa (LDI) i jonizacja
elektronowa (EI). Wybór techniki zależy od takich czynników jak polarność, masa
cząsteczkowa i stabilność termiczna cząsteczek próbki. LDI-MS jest techniką najczęściej
używaną do badań metabolomicznych - wykorzystuje laser do desorpcji i jonizacji
cząsteczek z próbki do analizy. Jego główną zaletą jest możliwość badania próbek, których
skuteczność jonizacji jest niska takie jak duże cząsteczki biologiczne. Można ją dostosować
do szerokiego zakresu typów próbek i zwykle wymaga minimalnego przygotowania próbki.
Po zjonizowaniu cząsteczek próbki powstałe jony są wprowadzane do analizatora masy.
Tam następuje ich rozdzielenie na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z). Na rynku
dostępne są różne typy analizatorów masy takie jak kwadrupolowy, czasu przelotu (TOF),
pułapka jonowa czy też Orbitrap. Każdy ma unikalne zalety i ograniczenia w zakresie
dokładności masy, zdolności rozdzielczej i szybkości skanowania. W TOF-MS
(Time-of-Flight Mass Spectrometry) jony są przyspieszane do określonej energii kinetycznej i
wprowadzane do analizatora masy, gdzie są rozdzielane na podstawie stosunku masy do
ładunku (m/z). Po rozdzieleniu jonów w analizatorze masy są one wykrywane przez
odpowiedni detektor jak powielacz elektronów lub kubek Faradaya. Detektor generuje sygnał
elektryczny proporcjonalny do liczby trafiających do niego jonów. Sygnały te są następnie
23
przekształcane w widmo masowe które pokazuje intensywność (liczebność) jonów w funkcji
wartości m/z. Na Rycinie 1 przedstawiono przykładowe widmo spektrometryczne z analizy
tkanki nowotworowej raka pęcherza moczowego. Ostatnim etapem jest analiza danych.
Otrzymane widma masowe są analizowane przy użyciu specjalistycznego oprogramowania
w celu identyfikacji i analizy ilościowej metabolitów. Może to obejmować wykrywanie
sygnałów i przeszukiwanie bazy danych w celu dopasowania obserwowanych wartości m/z
wzorów izotopowych i wzorów fragmentacji (dla eksperymentów MS/MS) do znanych
związków. Analiza ilościowa analitów jest zwykle osiągana przez porównanie intensywności
albo powierzchni sygnałów próbki z intensywnością lub powierzchnią wewnętrznych bądź
zewnętrznych wzorców.
Rycina 1. Przykładowe widmo spektrometryczne z analizy tkanki nowotworowej pęcherza
moczowego. Oś pozioma przedstawia stosunek masy (m) do ładunku (z) jonu (m/z). Oś
pionowa przedstawia intensywność (liczba zliczeń danego jonu przez detektor). Sygnały
pochodzą od jonów wytworzonych podczas jonizacji związków.
Kluczowe cechy MS to wysoka czułość co oznacza że może wykrywać metabolity w bardzo
niskich stężeniach, a to szczególnie przydatne w identyfikacji biomarkerów w stężeniach
śladowych. Inną cechą jest szeroki zakres dynamiczny, mianowicie MS może jednocześnie
analizować metabolity w szerokim zakresie stężeń w próbce. Dodatkowo MS cechuje
wszechstronność co oznacza, że może być sprzężony z różnymi technikami separacji,
takimi jak chromatografia cieczowa (LC-MS) lub chromatografia gazowa (GC-MS), w celu
uzyskania rozdziału chromatograficznego metabolitów, co poprawia zdolność i parametry
detekcji oraz identyfikacji złożonych mieszanin metabolitów.
24
1.3.1.1 Obrazowanie MS (Mass Spectrometry Imaging, MSI)
Spektrometria mas wykonywana w instrumentach ze źródłem jonów typu MALDI/SALDI
umożliwia dodatkowo przedstawienie rozkładu powierzchniowego wykrytych związków
próbki stałej (np. tkanki) w formie graficznej, w postaci tzw. obrazowania MS [33].
Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i desorpcja/jonizacja laserowa
wspomagana powierzchnią (SALDI) to techniki jonizacji stosowane w spektrometrii mas.
Procedura MALDI polega na wykorzystaniu lasera do jonizacji cząsteczek w próbce za
pomocą dodatkowo dodawanej do próbki matrycy. Analizowana próbka jest mieszana z
odpowiednim materiałem matrycy, a następnie naświetlana laserem. Matryca pochłania
energię lasera i pomaga w desorpcji oraz jonizacji cząsteczek próbki. Jony są kolejno
przyspieszane do analizatora masy w celu ich wykrycia. Technika ta nadaje się do analizy
biomolekuł, takich jak białka, peptydy i polimery, ponieważ powoduje niewielką fragmentację
próbki. SALDI jest modyfikacją MALDI, w której zamiast matrycy organicznej do
desorpcji/jonizacji laserowej wykorzystywane są powierzchnie nanostrukturalne.
Nanostrukturalną powierzchnią mogą być nanocząstki metali, nanorurki węglowe lub inne
nanostruktury. Podobnie jak w przypadku MALDI analizowana próbka jest umieszczana na
nanostrukturalnej powierzchni, a promieniowanie laserowe powoduje desorpcję i jonizację
cząsteczek próbki. Ze względu na zastosowanie nanostrukturalnych powierzchni SALDI
często oferuje lepszą odtwarzalność, niższe tło chemiczne na widmie MS i wymaga
mniejszych ilości próbek w porównaniu z MALDI [34].
Metoda obrazowania LDI-MS ma kilka zalet, które czynią ją cennym narzędziem,
szczególnie w dziedzinie badań biomedycznych. Kluczową siłą LDI-MSI jest jej wysoka
rozdzielczość przestrzenna. Pozwala to na graficzne mapowanie rozkładu metabolitów w
próbce tkanki, co jest szczególnie pomocne w badaniach nad nowotworami do identyfikacji
granic guzów i potencjalnych obszarów przerzutów. LDI-MSI charakteryzuje się również
zdolnością do wykrywania szerokiej gamy cząsteczek - od małych metabolitów do większych
białek i polipeptydów. Ten szeroki zakres wykrywalności sprawia, że jest to wszechstronny
instrument do badania złożonych systemów biologicznych. Kolejną zaletą LDI-MSI jest
możliwość jednoczesnego obrazowania wielu cząsteczek w jednym eksperymencie. Ta
zdolność jest szczególnie przydatna przy badaniu skomplikowanych układów biologicznych,
w których wiele cząsteczek może wchodzić w interakcje. Co więcej, LDI-MSI może
dostarczyć danych ilościowych na temat wykrywanych cząsteczek, umożliwiając porównanie
pewnych poziomów molekularnych pomiędzy różnymi próbkami tkanek, takimi jak zdrowe i
nowotworowe. Wreszcie, technika ta może być nieniszcząca dla próbki poprzez
zastosowanie tzw. imprintów - do wykonania analizy tkanki wystarczy tylko odcisk tkanki.
Daje to możliwość przeprowadzenia dalszych analiz lub walidacji przy użyciu innych metod
na tej samej próbce. Na Schemacie 2 przedstawiono przykładowe zastosowanie
obrazowania MS w raku nerki.
Obrazowanie MS może potencjalnie wspomóc w wielu aspektach badanie histopatologiczne.
Prawidłowa identyfikacja pochodzenia guza jest kluczowa dla spersonalizowanego leczenia.
W znacznej liczbie przerzutów nowotworowych, nie udaje się ustalić na podstawie badania
histopatologicznego w połączeniu z metodami immunohistochemicznymi pochodzenia guza
pierwotnego. Meding i wsp. udowodnili, że za pomocą obrazowania MS, można rozróżnić
sześć rodzajów gruczolakoraków (przełyk, pierś, jelito grube, wątroba, żołądek, tarczyca).
25
Udowodnili również, że dzięki niemu możliwe jest rozróżnienie między przerzutami raka jelita
grubego, pierwotnym guzem jelita grubego oraz rakiem wątrobowokomórkowym [30].
Schemat 2. Obrazowanie MS raka jasnokomórkowego nerki i przylegającego zdrowego
miąższu nerki z zastosowaniem metody AuNPET SALDI. Intensywność sygnału w
przypadku związku zidentyfikowanego jako digliceryd (18:1/20:2) jest około 50 razy większa
w rejonie z rakiem w porównaniu ze zdrową tkanką*.
*Nizioł J i wsp. Surface-Transfer Mass Spectrometry Imaging of Renal Tissue on Gold Nanoparticle Enhanced
Target. Anal Chem. 2016;88(14):7365-7371.)
Z uwagi na szybkość badania tkanki przy użyciu technologii obrazowania MS (10-30 min)
oraz brak potrzeby stosowania dodatkowych barwień, markerów i odczynników może mieć
ona zastosowanie w ocenie marginesów chirurgicznych w badaniu śródoperacyjnym. Ocena
marginesu chirurgicznego jest rzadko przeprowadzana śródoperacyjnie ze względu na
ograniczenia czasowe i małą precyzję takiej oceny. Rutynowe, patologiczne badanie
śródoperacyjne nie dostarcza także informacji molekularnych. Pirro i wsp. pokazali, że
obrazowanie MS może być użyteczne w śródoperacyjnej ocenie marginesów chirurgicznych
- w trakcie resekcji glejaka mózgu (czułość 93%), a pomiary molekularne mogą być szybko
wykonywane na tkankach podczas operacji w celu identyfikacji typów tkanek, oceny
naciekania nowotworu oraz identyfikacji obecności mutacji prognostycznych poprzez
oznaczenie onkometabolitów i fosfolipidów [31].
1.3.2 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
Spektroskopia NMR jest kolejną techniką stosowaną w badaniach metabolomicznych.
Opiera się na obserwacji zachowania jąder atomowych w polu magnetycznym, co pozwala
na identyfikację oraz analizę ilościową metabolitów na podstawie ich odmiennego otoczenia
chemicznego i częstotliwości rezonansowych [35].
26
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego działa na zasadzie właściwości
magnetycznych niektórych jąder, takich jak wodór-1 czy węgiel-13. Gdy próbka jest
umieszczona w silnym i jednorodnym polu magnetycznym, jądra te ustawiają się zgodnie z
kierunkiem pola magnetycznego, a każde z nich obraca się wokół własnej osi. Przyłożone
pole magnetyczne rozdziela poziomy energetyczne wirujących jąder, tworząc różnicę między
stanem o niższej energii (zgodnym z kierunkiem polem) a stanem o wyższej energii
(niezgodnym z kierunkiem pola). Następnie stosowany jest impuls o częstotliwości radiowej,
który odpowiada luce energetycznej między niższymi i wyższymi stanami energetycznymi.
Energia ta powoduje, że jądra zmieniają swój stan spinowy, pochłaniając energię i
przechodząc do stanu o wyższej energii. Po wyłączeniu impulsu jądra rozluźniają się z
powrotem do pierwotnego stanu spinowego, uwalniając energię, którą wcześniej pochłonęły.
Energia uwalniana podczas relaksacji, w formie fal radiowych, jest wykrywana przez NMR.
Czas potrzebny na relaksację jąder i ilość energii, którą uwalniają, zależą od otoczenia
chemicznego każdego jądra i dostarcza szczegółowych informacji o strukturze cząsteczki.
Spektrometr NMR wykorzystuje te dane do wygenerowania widma, które można
zinterpretować w celu określenia struktury molekularnej próbki. Należy zauważyć, że NMR
jest techniką niedestrukcyjną, co oznacza, że próbkę można odzyskać w niezmienionej
postaci po zakończeniu pomiarów. Technika ta ma szerokie zastosowanie w takich
dziedzinach jak chemia organiczna, chemia medyczna i biochemia. Głównym ograniczeniem
analizy NMR jest niższa czułość w porównaniu z MS, co może utrudniać wykrywanie
metabolitów o niskim stężeniu.
1.3.3 Zalety i wady poszczególnych metod analizy chemicznej
Spektrometria masowa (MS) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)
są szeroko stosowane w badaniach metabolomicznych, a każda z metod ma swoje zalety i
wady [36,37]. Główną zaletą MS jest wysoka czułość, co oznacza, że może wykryć nawet
niewielkie ilości metabolitów w próbce. Połączenie chromatografii ze spektrometrią lub
zastosowanie nowoczesnych metod jonizacji, tj. MALDI/SALDI, pozwala na oznaczenie
szerszego zakresu metabolitów, które może analizować, w tym polarne, niepolarne i lotne
związki. Analiza metabolomiczna oparta na MS może być stosunkowo szybka, co czyni ją
odpowiednią do badań na dużą skalę i z udziałem wielu próbek.
MS ma jednak pewne wady. Często wymaga złożonego przygotowania próbki, co może
wprowadzić zmienność i potencjalne błędy. Wiele technik MS wymaga wstępnego etapu
separacji chromatograficznej, takiego jak chromatografia gazowa lub chromatografia
cieczowa, a to może być czasochłonne i prowadzić do utraty bądź degradacji próbki.
Obecność innych związków w matrycy próbki może wpływać na jonizację i wykrywanie
metabolitów, powodując tłumienie lub wzmacnianie jonów. Ponadto, aby zidentyfikować i
oznaczyć ilościowo metabolity, MS często wymaga znanych standardów referencyjnych.
Stanowi to pewne ograniczenie, ponieważ nie wszystkie metabolity mają komercyjnie
dostępne standardy.
Spektrometria masowa dostarcza danych o stosunku masy do ładunku (m/z) jonów, które
mogą być wykorzystane do wnioskowania o masie cząsteczkowej i elementach
strukturalnych związku. Jednak różne związki mogą czasami dawać podobne wartości m/z,
co prowadzi do niejednoznaczności. Co więcej, baza danych używana do dopasowywania
może nie być całkowicie wyczerpująca, co za tym idzie - mogą istnieć nieznane związki,
27
które pasują do obserwowanych danych, ale nie są uwzględnione w bazie danych. Aby
jednoznacznie zidentyfikować metabolit, często wymagane są dodatkowe metody
identyfikacji. W tym celu stosowana jest tandemowa spektrometria mas (MS/MS) i/lub
spektrometria mas o wysokiej albo ultrawysokiej rozdzielczości (HRMS). MS/MS dostarcza
informacji strukturalnych o metabolitach, które mogą pomóc w jego identyfikacji, podczas
gdy HRMS zapewnia dokładniejsze wartości m/z, które mogą pomóc zawęzić opcje
identyfikacji. Eksperymenty tandemowe MS (MS/MS) mogą dostarczyć dodatkowych danych
strukturalnych o metabolitach, wspomagając identyfikację i walidację. MS/MS jest
dwuetapowym procesem, który pomaga zidentyfikować cząsteczki w oparciu o dodatkowe
dane strukturalne niż pojedyncza analiza spektrometrii mas. Pierwszy etap jest podobny do
typowego eksperymentu spektrometrii masowej, gdzie cząsteczki są jonizowane i sortowane
na podstawie ich stosunku masy do ładunku. Jednakże, w przeciwieństwie do
jednostopniowej spektrometrii mas, MS/MS na tym nie kończy. Wykorzystuje niektóre z
posortowanych jonów i rozbija je na mniejsze części, czyli fragmenty. Odbywa się to za
pomocą procesu zwanego dysocjacją indukowaną zderzeniem, gdzie jony są przyspieszane
i zderzają się z gazem obojętnym, powodując ich rozpad. Te pofragmentowane jony są
następnie analizowane w drugim etapie procesu MS/MS. Otrzymane widma dostarczają
informacji o strukturze cząsteczek, w tym sekwencji peptydów lub strukturze metabolitu, co
może być cenne dla identyfikacji nieznanych metabolitów albo potwierdzenia identyfikacji
danych metabolitów. Dlatego MS/MS jest szeroko stosowany w badaniach proteomiki i
metabolomiki.
Z drugiej strony, magnetyczny rezonans jądrowy ma swój unikalny zestaw zalet. Dostarcza
szczegółowych informacji strukturalnych o metabolitach, co czyni go doskonałym
narzędziem do identyfikacji i charakterystyki nieznanych związków. NMR pozwala na analizę
ilościową metabolitów bez potrzeby stosowania zewnętrznych lub wewnętrznych wzorców,
ponieważ intensywność sygnału jest wprost proporcjonalna do stężenia analitu. NMR
wymaga zwykle mniej złożonego przygotowania próbki w porównaniu z MS, co zmniejsza
potencjał zmienności i błędu systematycznego. Ponadto NMR jest techniką nieniszczącą, co
pozwala na odzyskanie próbki po analizie w celu dalszego badania lub zastosowania technik
uzupełniających.
Jednakże NMR ma również ograniczenia, np. znacznie niższą czułość w porównaniu z MS,
może nie wykryć metabolitów obecnych w niskich stężeniach [28,29]. W praktyce oznacza to
możliwość oznaczenia w badanej próbce biologicznej zwykle do 100 związków chemicznych
co może utrudniać wykrywanie metabolitów o niskim stężeniu w złożonych próbkach. Dla
porównania MS pozwala na oznaczenie w tych samych próbkach ponad 1000 różnych
związków [29]. NMR jest bardziej odpowiedni do analizy polarnych i nielotnych metabolitów,
podczas gdy jego przydatność do związków niepolarnych i lotnych jest ograniczona.
Nakładające się sygnały w złożonych próbkach biologicznych mogą sprawić, że analiza
spektralna NMR będzie wyzwaniem, szczególnie w przypadku mieszanin zawierających
liczne metabolity. Wysokopolowe spektrometry NMR są drogie w zakupie i wymagają
specjalistycznej konserwacji, a to może ograniczać dostępność dla niektórych laboratoriów.
1.3.4 Analiza danych, identyfikacja metabolitów, mapowanie ścieżek metabolicznych
W badaniach metabolomicznych, analiza danych, identyfikacja metabolitów i wyznaczanie
szlaków metabolicznych to kluczowe kroki do uzyskania wglądu w złożone systemy
28
biologiczne. Różne metody, oprogramowanie i bazy danych zostały opracowane w celu
ułatwienia tych zadań, umożliwiając naukowcom odkrycie cennych informacji biologicznych z
zawiłych danych metabolomicznych [38].
Analiza danych w metabolomice obejmuje kilka etapów, takich jak przetwarzanie wstępne,
normalizacja, skalowanie i analiza statystyczna. Przetwarzanie wstępne obejmuje redukcję
szumów, korekcję linii podstawowej, wykrywanie sygnałów i wyrównanie, podczas gdy
normalizacja danych i skalowanie pomagają uwzględnić różnice w stężeniu próbki lub
odpowiedzi urządzenia. Pozwala to na dokładniejsze porównania pomiędzy różnymi
próbkami albo eksperymentami. Analizy metabolomiczne, a w szczególności niecelowana
analiza metabolomiczna, prowadzą do powstania złożonych zbiorów danych. Dlatego też
stworzono narzędzia analityczne, które są kluczowe dla przetwarzania i interpretacji tych
wyników. Pomagają w rozwiązywaniu problemów z przetwarzaniem dużej ilości danych,
analizami statystycznymi, identyfikacją metabolitów oraz umiejscowieniem ich w
poszczególnych szlakach metabolicznych. Rodzaje analiz statystycznych, które można
zastosować odnośnie do danych metabolomicznych są bardzo obszerne a wybór
właściwego testu może stanowić wyzwanie. Przykłady oprogramowania do analizy danych
obejmują MetaboAnalyst, platformę internetową do kompleksowej analizy, wizualizacji i
interpretacji danych metabolomicznych, czy też oprogramowanie ogólne, np. SIMCA lub
MatLAB.
Po wykryciu metabolitów i porównaniu ich poziomów pomiędzy grupami eksperymentalnymi,
kolejnym krokiem jest identyfikacja konkretnych związków odpowiedzialnych za
obserwowane zmiany. Często wymaga to porównania zmierzonego stosunku masy do
ładunku (m/z), czasu retencji i wzorców fragmentacji (dla danych MS) lub przesunięć
chemicznych i stałych sprzężenia (dla danych NMR) z danymi referencyjnymi dostępnymi w
bibliotekach spektralnych albo bazach danych. Bazy danych do identyfikacji metabolitów
obejmują Human Metabolome Database (HMDB), która oferuje szczegółowe informacje na
temat ludzkich metabolitów, METLIN, bazę danych metabolitów zawierającą widma MS/MS i
inne informacje dla wielu związków, MassBank, publiczne repozytorium danych widm
masowych oraz Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB), bazę danych widm
NMR dla różnych biomolekuł.
Mapowanie zidentyfikowanych metabolitów na szlaki metaboliczne jest kluczowe dla
zrozumienia procesów biologicznych leżących u podstaw obserwowanych zmian. Może to
pomóc w zidentyfikowaniu ścieżek metabolicznych, które uległy zmianie, i wygenerowaniu
hipotez dotyczących mechanizmów napędzających różnice między grupami
eksperymentalnymi. Narzędzia i bazy danych do mapowania ścieżek metabolicznych
obejmują Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), wspomniany MetaboAnalyst
Pathway Analysis, MetScape oraz Reactome.
1.3.5 Analiza statystyczna w badaniach metabolomicznych
Metodologia stosowana do interpretacji danych metabolomicznych zostały zaadaptowane od
powstałych wcześniej analiz genomicznej i transkryptomicznej. Klasyczne podejście
analityczne polega na ocenie różnic grupowych. W tym celu stosuję się analizy
jednozmiennowe i wielozmiennowe [39,40,41]. Jednym z narzędzi wykorzystywanych w
analizie statystycznej danych metabolomicznych jest MetaboAnalyst 5.0 [42]. To
29
kompleksowe narzędzie online do analizy danych metabolomicznych, które integruje szereg
zaawansowanych metod statystycznych i uczenia maszynowego, obejmując wszystkie etapy
analizy danych metabolomicznych. Proces ten zakłada wstępne przetwarzanie i
normalizację danych, eksploracyjną analizę danych oraz interpretację funkcjonalną.
Przetwarzanie i normalizacja danych są kluczowymi krokami wstępnymi, a narzędzie to
oferuje szeroką gamę metod normalizacji, w tym normalizację według sumy, mediany,
skalowania Pareta i automatycznego skalowania. MetaboAnalyst zapewnia odmienne
sposoby wizualizacji danych wielowymiarowych, takie jak analiza głównych składowych,
mapy cieplne i hierarchiczne grupowanie, które mają kluczowe znaczenie dla wstępnej
kontroli danych, identyfikacji wartości odstających i rozróżniania grup. Jeśli chodzi o analizę
statystyczną, obejmuje ono połączenie metod jedno- i wielowymiarowych. Techniki takie jak
testy t, analiza wariancji i volcan plot pomagają w analizie jednowymiarowej, podczas gdy
częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (PCA) i ortogonalna
częściowa analiza dyskryminacyjna metodą najmniejszych kwadratów (OPLSDA) mogą być
stosowane do analizy wielowymiarowej. Techniki te wspomagają identyfikację najbardziej
dyskryminujących metabolitów, które różnicują odmienne grupy próbek. W przypadku
bardziej złożonych projektów eksperymentalnych narzędzie obejmuje metody statystyczne,
takie jak analiza szeregów czasowych i dwuczynnikowa ANOVA. Jeśli chodzi o uczenie
maszynowe, jest kilka metod, takich jak vector machines, random forests i k-nearest
neighbors, przydatnych do zadań klasyfikacji i przewidywania. W narzędziu tym dostępna
jest również analiza ścieżek i analiza wzbogacenia ścieżek, które przy użyciu
zidentyfikowanych metabolitów mogą podkreślić najistotniejsze szlaki metaboliczne i
zapewnić wgląd w biologiczne mechanizmy stojące za obserwowanymi zmianami w
metabolomie. Wreszcie, narzędzie zapewnia również też walidację modeli i ocenę istotności
statystycznej za pomocą takich metod jak testy permutacyjne czy walidacja krzyżowa.
Jednowymiarowe metody statystyczne
Jednowymiarowe metody statystyczne analizują jedną zmienną jednocześnie i porównują
poziomy każdego metabolitu indywidualnie pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Przykłady tych metod obejmują test t-Studenta, który porównuje średnie dwóch grup; analiza
wariancji (ANOVA), która porównuje średnie wielu grup. Jeśli ANOVA wykaże znaczące
różnice, przeprowadzane są testy post-hoc w celu określenia, które konkretne grupy różnią
się od siebie. Krotność zmiany (fold-change, FC), która jest stosunkiem średnich poziomów
metabolitów między dwiema grupami eksperymentalnymi. Test U Manna-Whitneya lub test
Kruskala-Wallisa to testy nieparametryczne, które mogą być stosowane, gdy dane nie
spełniają założeń testu t-Studenta ani ANOVA (np. gdy dane nie mają rozkładu normalnego).
WIelowymiarowe analizy statystyczne
Z drugiej strony wielowymiarowe metody statystyczne obejmują równoczesną analizę wielu
zmiennych, biorąc pod uwagę zależności między metabolitami i ogólne wzorce w danych.
Wyróżnia się dwie główne grupy analiz statystycznych stosowanych w metabolomice:
analizy nadzorowane i nienadzorowane.
- Metody nienadzorowane. W analizie statystycznej metody nienadzorowane
koncentrują się na znajdowaniu wzorców, struktur lub związków w danych bez
opierania się na znanych etykietach czy wynikach. Analiza składowych głównych
30
(Principal Component Analysis, PCA) to technika nienadzorowanej analizy, która jest
często stosowana w metabolomice do redukcji wymiarowości danych i wizualizacji
złożoności próbek. PCA identyfikuje główne składowe w danych, które wyjaśniają
największą wariancję. Może być używana do analizy podobieństw i różnic między
próbkami, bez uwzględniania żadnych z góry określonych grup próbek. Pozwala na
zidentyfikowanie wzorców i tendencji w danych metabolomicznych, co może
prowadzić do dalszych analiz i hipotez badawczych.
- Metody nadzorowane. W analizie statystycznej metody nadzorowane wykorzystują
zbiory danych ze znanymi etykietami lub wynikami do budowy modeli, które mogą
przewidzieć etykiety dla nowych, niewidzianych danych. Analiza dyskryminacyjna
oparta na ortogonalnej projekcji do najmniejszych kwadratów (Orthogonal Projection
to Latent Structures Discriminant Analysis, OPLS-DA) to przykład analizy
nadzorowanej, która jest wykorzystywana do identyfikacji metabolitów różniących się
między z góry zdefiniowanymi grupami próbek. OPLS-DA jest rozwinięciem PCA,
które uwzględnia informacje o klasach próbek. Tworzy model dyskryminacyjny
pozwalający na przewidywanie przynależności próbek do określonych grup na
podstawie ich profili metabolomicznych. Może być stosowany do identyfikacji
biomarkerów różnicujących odmienne grupy próbek, np. próbki zdrowych i chorych.
Podsumowując, PCA jest przykładem analizy nienadzorowanej w metabolomice, która służy
do redukcji wymiarowości danych i wizualizacji złożoności próbek. OPLS-DA natomiast jest
przykładem analizy nadzorowanej, która pozwala na identyfikację metabolitów różniących
się między zdefiniowanymi grupami próbek. Zarówno PCA, jak i OPLS-DA są szeroko
stosowane w metabolomice oraz dostarczają cennych informacji na temat wzorców i różnic
w danych metabolomicznych.
Metody uczenia maszynowego
Techniki uczenia maszynowego są wykorzystywane do złożonych zadań, takich jak
przewidywanie wyników lub klasyfikowanie próbek na podstawie zestawu cech, w tym
przypadku metabolitów. Techniki te są szczególnie przydatne, gdy istnieje wiele zmiennych
(tj. metabolitów) i zachodzą między nimi złożone relacje [43].
- Maszyny wektorów nośnych (support vector machines, SVM): popularna metoda
uczenia maszynowego stosowana zarówno do klasyfikacji, jak i regresji. W
metabolomice SVM może być wykorzystywana do rozróżniania odmiennych klas
próbek (np. choroba vs. kontrola) na podstawie ich profili metabolitów. Główną ideą
SVM jest znalezienie hiperpłaszczyzny, która najlepiej oddziela klasy, jednocześnie
maksymalizując margines między najbliższymi próbkami każdej klasy (wektory
wsparcia).
- Lasy losowe (random forest, RF): to wszechstronna metoda wykorzystująca zespół
drzew decyzyjnych. Każde drzewo jest budowane przy użyciu próbki bootstrapowej
danych, a ostateczna prognoza opiera się na większości głosów (w przypadku
klasyfikacji) lub średniej (w przypadku regresji) wszystkich drzew [44]. Bootstrap to
technika statystyczna polegająca na tworzeniu nowych próbek z istniejącego zbioru
danych poprzez losowe wybieranie punktów danych z szansą na wielokrotne
wybranie tego samego punktu danych. Lasy losowe mogą uchwycić złożone,
nieliniowe zależności między zmiennymi, a także zapewniają miarę ważności
31
zmiennej, którą można wykorzystać do identyfikacji najbardziej wpływowych
metabolitów.
- Algorytm k-najbliższych sąsiadów (k-nearest neighbours, KNN): prosta, ale
skuteczną metodą klasyfikacji i regresji. W przypadku klasyfikacji w metabolomice
próbka jest klasyfikowana na podstawie klasy większościowej jej k najbliższych
sąsiadów w przestrzeni metabolitów.
- Uczenie głębokie (deep learning): algorytmy głębokiego uczenia, w szczególności
sztuczne sieci neuronowe (ANN), są coraz częściej wykorzystywane do analizy
danych metabolomicznych. Składają się z warstw połączonych węzłów lub
"neuronów" i mogą modelować złożone, nieliniowe zależności. Konwolucyjne sieci
neuronowe (CNN) i rekurencyjne sieci neuronowe (RNN) to inne formy modeli
głębokiego uczenia wykorzystywane w konkretnych zastosowaniach.
Słownik pojęć statystycznych stosowanych w publikacjach
PCA (Principal Component Analysis - analiza głównych składowych) to technika
statystyczna używana do redukcji wymiarowości danych. Często sięga się po nią w celu
uproszczenia złożonych zestawów danych, jednocześnie starając się zachować jak
najwięcej informacji zawartych w tych danych. PCA przekształca oryginalne zmienne,
które mogą być ze sobą skorelowane, w nowe, niezależne "główne składowe". Pierwsza
główna składowa (PCA1) wyjaśnia najwięcej zmienności w danych, a każda kolejna
główna składowa (PCA2) wyjaśnia jak najwięcej pozostałej zmienności, będąc
jednocześnie ortogonalną (prostopadłą) do poprzednich składowych. PCA jest używana
do wizualizacji ogólnej struktury danych, identyfikacji grup lub klastrów oraz wykrywania
obserwacji odstających (outlierów).
OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis - ortogonalna
analiza dyskryminacyjna częściowych najmniejszych kwadratów) to metoda
statystyczna używana do budowy modeli predykcyjnych dla danych z góry zdefiniowanych
klas (np. zdrowy vs. chory). To nadzorowana metoda, która różni się od PCA tym, że nie
tylko redukuje wymiarowość danych, lecz także maksymalizuje różnice między
zdefiniowanymi klasami. Metoda ta jest często używana w metabolomice, gdy interesuje
nas zidentyfikowanie metabolitów różniących się pomiędzy grupami. OPLS-DA separuje
zmienność w danych, która jest bezpośrednio powiązana z wynikiem zainteresowania
(tzw. zmienność predyktywną), od zmienności, która nie jest z tym wynikiem związana
(tzw. zmienność ortogonalna). Dzięki temu łatwiej identyfikować metabolity, które są
istotne w różnicowaniu grup.
Korekta Bonferroniego i współczynnik fałszywych odkryć (FDR) to techniki
statystyczne służące do korekty porównań wielokrotnych. Biorąc pod uwagę, że badanie
metabolomiczne może przeprowadzać testy na tysiącach metabolitów jednocześnie,
kontrolowanie odsetka wyników fałszywie dodatnich ma kluczowe znaczenie.
Korekta Bonferroniego to metoda w której poziom istotności jest dzielony przez liczbę
porównań (np. w przypadku testowania 20 metabolitów, wynik uznany będzie za istotny,
gdy wartość p jest niższa niż 0,05/20 = 0,0025). Może być jednak zbyt rygorystyczna w
32
sytuacjach, w których przeprowadzanych jest wiele testów, co prowadzi do wysokiego
wskaźnika wyników fałszywie ujemnych.
Współczynnik fałszywych odkryć (FDR) to mniej rygorystyczna metoda niż korekta
Bonferroniego i często stosowana podczas przeprowadzania dużej liczby testów.
Kontroluje oczekiwany odsetek nieprawidłowo odrzuconych hipotez zerowych (fałszywych
odkryć). Procedura Benjamini-Hochberg jest powszechnie stosowaną metodą kontroli
FDR.
VIP (Variable Influence on Projection - wpływ zmiennej na projekcję) to parametr
statystyczny używany w analizie wielowymiarowej, takich jak regresja cząstkowa
najmniejszych kwadratów (PLS) i ortogonalna regresja cząstkowa najmniejszych
kwadratów (OPLS). VIP mierzy znaczenie każdej zmiennej (w tym przypadku metabolitu)
w projekcji lub rozróżnianiu między odmiennymi grupami albo klasami. Określa wkład
każdej zmiennej w model predykcyjny. Zmienne o wyższych wartościach VIP są uważane
za mające większy wpływ na model i są bardziej istotne w rozróżnieniu między grupami.
W kontekście studiów metabolomicznych lub innych studiów omicznych, wartości VIP
często są używane do wyboru istotnych zmiennych bądź biomarkerów, które znacząco
przyczyniają się do separacji lub klasyfikacji różnych grup próbek (np. tkanka
nowotworowa vs. zdrowa). Połączenie wartości VIP z innymi miarami statystycznymi,
takimi jak analiza współczynnika zmiany, FC (fold change) i test t, pozwala na
zidentyfikowanie metabolitów, które wykazują istotne różnice między grupami i mają
potencjalną wartość diagnostyczną lub predykcyjną.
R2Y i Q2 oraz test permutacji - to parametry statystyczne stosowane przy walidacji
modeli wielowymiarowych, takich jak te generowane ortogonalną analizę dyskryminacyjną
najmniejszych kwadratów częściowych (OPLS-DA).
R2Y: parametr często określy się jako "dopasowanie modelu". Reprezentuje proporcję
wariancji zmiennej odpowiedzi (Y), którą można wyjaśnić za pomocą modelu. Jest to
miara, jak dobrze model pasuje do zaobserwowanych danych. Wartość R2Y wynosząca 1
wskazuje na doskonałe dopasowanie, natomiast wartość bliżej 0 wskazuje na słabe
dopasowanie.
Q2: miara "zdolności predykcyjnej" modelu. Oblicza się ją za pomocą metod walidacji
krzyżowej i szacuje, jak dobrze model może przewidzieć nowe dane. Wartość Q2 bliżej 1
wskazuje na doskonałą zdolność predykcyjną, podczas gdy wartość bliżej 0 sugeruje
słabą zdolność predykcyjną. Ujemna wartość Q2 może sygnalizować nadmierne
dopasowanie modelu, co oznacza, że model może opisywać szum zamiast bazowy trend.
Test permutacji: technika statystyczna, która polega na przetasowaniu, czyli losowym
przestawieniu danych, a następnie porównaniu przetasowanych danych z tymi
oryginalnymi. Celem jest ustalenie, czy obserwowany efekt jest istotny, czy może wynika
po prostu z losowości. Gdy wykonujemy test permutacji z 2000 powtórzeniami,
przetasowujemy dane 2000 razy, za każdym razem obliczając interesującą nas statystykę
(np. różnicę średnich). Każde przetasowanie daje jedno "symulowane" wyniki. Wyniki tych
2000 symulacji tworzą rozkład statystyki testowej pod hipotezą zerową (tj. hipotezą, że
33
obserwowany efekt jest wynikiem losowości). Możemy teraz porównać naszą rzeczywistą
obserwację (statystykę obliczoną na oryginalnych, nieprzetasowanych danych) z tym
rozkładem. Jeżeli rzeczywista obserwacja jest ekstremalna z rozkładem z symulacji (np.
jest w najmniejszym 5% lub największym 5% wyników), to należy odrzucić hipotezę
zerową i uznać, że obserwowany efekt jest statystycznie istotny.
FC (Fold change - współczynnik zmiany) to wskaźnik używany do porównywania
poziomu metabolitów między dwiema różnymi grupami próbek. Odnosi się do wielkości
zmiany w stężeniu metabolitów między tymi grupami. Jest obliczany jako stosunek
średniego stężenia metabolitu w jednej grupie do średniego stężenia w drugiej. Wartość
fold change wyraża ilekroć stężenie metabolitu wzrasta lub maleje między grupami. Na
przykład, fold change wynoszący 2 oznacza, że stężenie metabolitu jest dwukrotnie
większe w jednej grupie w porównaniu z drugą.
Modelowanie random forest to popularny algorytm uczenia maszynowego, który należy
do kategorii metod uczenia zespołowego. Nazwa pochodzi od lasu drzew decyzyjnych
generowanych losowo, które łączą swoje wyniki, aby dokonać predykcji. Można to
porównać z komitetem ekspertów, gdzie każde drzewo decyzyjne to jeden ekspert. Każdy
ekspert (drzewo) wydaje swoją opinię (prognozę), a następnie decyzja komitetu (lasu) jest
podejmowana na podstawie najczęściej występującej opinii (głosowania
większościowego). Etapy modelowania:
1. Tworzenie drzew decyzyjnych: random forest tworzy wiele drzew decyzyjnych,
każde z nich trenowane na różnych podzbiorach danych. To jakby mieć różnych
ekspertów specjalizujących się w różnych obszarach.
2. Prognozowanie: kiedy mamy nowe dane do prognozowania, każde drzewo
decyzyjne (ekspert) dokonuje swojej prognozy.
3. Głosowanie: wszystkie prognozy zostają zebrane i najczęściej występująca staje
się prognozą random forest. To jakby zbierać opinie wszystkich ekspertów, a
potem decydować, idąc za najpopularniejszą z nich.
ROC (Receiver Operating Characteristic - krzywa charakterystyki operacyjnej
odbiornika) to wykres przedstawiający zależność między czułością (True Positive Rate) a
1-swoistością (False Positive Rate) w różnych punktach odcięcia dla danego modelu
diagnostycznego. ROC jest szeroko stosowana w analizie diagnostycznej i ocenie
skuteczności modeli klasyfikacyjnych.
AUC (Area Under the Curve - obszar pod krzywą to parametr który ocenia zdolność
modelu do rozróżnienia między dwiema klasami lub grupami. Mierzy powierzchnię pod
krzywą ROC. Im większa wartość AUC, tym lepsza zdolność modelu do rozróżnienia
między klasami. AUC równa 1 oznacza doskonałą zdolność rozróżniania, AUC równa 0,5
wskazuje na brak zdolności rozróżniania, a AUC poniżej 0,5 sugeruje
przeciwną interpretację klasyfikacji.
Krzywa ROC i AUC są często stosowane w badaniach diagnostycznych, aby ocenić
skuteczność modeli w rozpoznawaniu choroby. Są szczególnie przydatne, gdy modele
generują wyniki binarne, takie jak choroba/niechoroba. Krzywa ROC i AUC dostarczają
informacji o czułości i swoistości modelu oraz pozwalają na wybór optymalnego punktu
34
odcięcia, który zapewnia równowagę między tymi dwoma wskaźnikami. W badaniach
metabolomicznych, ROC i AUC używane są w analizie biomarkerów. Oceniają
skuteczność różnych metabolitów jako biomarkerów różnicujących tkankę nowotworową
od tkanki zdrowej. AUC wykorzystuje się do określenia efektywności diagnostycznej tych
metabolitów. Metabolity o wyższych wartościach AUC są uważane za bardziej obiecujące
ze względu na lepsze rozróżnianie między grupami próbek nowotworowych i zdrowych.
35
Rozdział 2: Założenia i cel pracy
Założenia leżące u podstaw tej rozprawy obejmują przekonanie, że profil metaboliczny
pacjentów z rakiem pęcherza moczowego wyraźnie różni się od profilu osób zdrowych.
Zakłada się, że różnica ta może być wykryta w surowicy, tkance i moczu przy użyciu
zaawansowanych technik analizy metabolomicznej. Uznano, że metody analizy chemicznej
takie jak NMR i MS w połączeniu z rozbudowanymi narzędziami bioinformatycznymi oraz
metodami analizy statystycznej pozwolą na wykrycie takich związków. Rozprawa zakłada, że
wszelkie zidentyfikowane biomarkery mogą być stosowane jako wiarygodne wskaźniki do
diagnozowania, prognozowania i monitorowania terapeutycznego raka pęcherza
moczowego. Przyjmuje się również, że badana grupa chorych reprezentuje szerszą grupę
demograficzną osób z rakiem pęcherza moczowego, co zapewnia szerokie zastosowanie
wyników badań. Ponadto zakłada się, że metodologie i techniki zastosowane w badaniu, w
oparciu o współczynniki statystyczne przyniosą dokładne i wiarygodne wyniki.
Rozprawa doktorska ma na celu wykorzystanie analizy metabolomicznej surowicy, tkanki i
moczu do wskazania potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego. Poprzez
analizę profili metabolicznych i porównanie pacjentów z rakiem pęcherza moczowego i osób
zdrowych, badanie ma ujawnić określone metabolity lub szlaki metaboliczne, które mogłyby
działać jako wczesne markery diagnostyczne, czynniki ryzyka albo cele terapeutyczne.
Badania mają na celu poszerzenie istniejącej wiedzy na temat raka pęcherza moczowego i
utorowanie drogi do bardziej precyzyjnych i mniej inwazyjnych metod diagnostycznych oraz
ukierunkowanych opcji leczenia. Ostatecznym celem jest poprawa wyników leczenia
pacjentów, zmniejszenie obciążenia chorobą i poprawa jakości życia osób, u których
zdiagnozowano raka pęcherza moczowego.
Cele główne:
1. Analiza metabolomiczna tkanki, surowicy i moczu z zastosowaniem spektrometrii mas
oraz spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego.
2. Identyfikacja pojedynczych metabolitów (biomarkerów) i/lub grup metabolitów które będą
rozróżniać pomiędzy tkanką, surowicą oraz moczem nowotworowym i kontrolnym.
3. Ocena analitycznej wiarygodności wykrytych biomarkerów. Będzie się ona opierać na
wielowymiarowej analizie statystycznej z zastosowaniem metod takich jak PCA i OPLS-DA
oraz parametrach statystycznych takich jak: czułość, swoistość, AUC, FC i VIP, dla
poszczególnych związków i grup związków.
Cele poboczne:
1. Identyfikacja szlaków metabolicznych w których występują zidentyfikowane metabolity.
2. Próba zidentyfikowania metabolitów różnicujących poszczególne stopnie zaawansowania
klinicznego oraz stopnie złośliwości histopatologicznej.
3. Ustalenie czy metoda obrazowania MS (LDI-MSI) może wspomóc badanie
histopatologiczne w postawieniu prawidłowej diagnozy w trudnych przypadkach oraz w
wspomagać w wyznaczaniu marginesów resekcji guza nowotworowego.
Cele planuje się osiągnąć poprzez:
1. Zastosowanie nie-celowanej i celowanej analizy metabolomicznej tkanki, surowicy i
moczu pobranych od grupy 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz 100 osób
36
zdrowych, z zastosowaniem spektrometrii mas oraz spektroskopii magnetycznego
rezonansu jądrowego.
2. Obrazowanie tkanki nowotworowej i zdrowej metodą LDI MSI.
3. Zastosowanie chemometrycznych metod analizy danych do identyfikacji statystycznie
istotnych metabolitów/biomarkerów różnicujących próbki pochodzące od osób z rakiem
pęcherza moczowego z próbkami kontrolnymi, planowane jest zastosowanie internetowych
narzędzi, tj. MetaboAnalyst 4.0 i/lub XCMS Online do analizy statystycznej uzyskanych
wyników: zarówno podstawowej analizy jednozmiennowej (np. za pomocą testu t-Studenta),
jak i analiz wielozmiennowych, tj. analiza głównych składowych - PCA (Principal Component
Analysis) oraz dyskryminacyjny wariant metody cząstkowych najmniejszych kwadratów -
PLS-DA (Partial Least Squares Discriminant Analysis).
4. Analizy szlaków metabolicznych związanych z nowymi markerami.
37
Rozdział 3: Materiały i metody
3.1 Protokół badania, przygotowanie materiału
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną przy Uniwersytecie
Rzeszowskim (pozwolenie nr 2018/04/10) i przeprowadzony zgodnie z odpowiednimi
wytycznymi i przepisami, m.in. Deklaracją helsińską z 1964 roku i jej późniejszymi zmianami.
Próbki i dane kliniczne od pacjentów biorących udział w badaniu zostały pobrane za
pisemną zgodą.
Do badań metabolomicznych raka pęcherza moczowego zgromadzono fragmenty tkanek,
próbek surowicy i moczu od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz 100
kontrolnych próbek surowicy i moczu. Tkanki kontrolne stanowiły fragmenty zdrowej
śluzówki pęcherza moczowego pobrane w trakcie zabiegu TURBT od pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego. Od każdego pacjenta pobrano zarówno fragment tkanki
nowotworowej jak i fragment zdrowej śluzówki pęcherza moczowego, każda o wymiarach
około 6 x 6 mm (ok. 5 mg). Celem weryfikacji histopatologicznej preparatów (zarówno
nowotworowej, jak i kontrolnej - prawidłowej) podzielono je na dwie części - jedna została
poddana badaniu histopatologicznemu a drugą zamrożono w temperaturze -60°C. Mocze i
surowice kontrolne pochodzą od pacjentów przyjętych na oddział urologii celem wykonania
diagnostyki lub leczenia zabiegowego łagodnych schorzeń w obrębie układu moczowego, tj.
przerost prostaty, zwężenie cewki moczowej i zwężenie podmiedniczkowe moczowodu,
stulejka, wodniak jądra, żylaki powrózka nasiennego, nietrzymanie moczu i inne. Każdy
pacjent z grupy kontrolnej miał wykonany w ramach hospitalizacji podstawowy pakiet badań
laboratoryjnych (w tym badanie ogólne moczu) i obrazowych (USG jamy brzusznej).
Stanowiło to podstawę do wykluczenia raka pęcherza moczowego w grupie kontrolnej. U
każdego pacjenta, do badania pobrano około 2.6ml krwi oraz 50 ml moczu. Krew była
odwirowana przy 3000 obr/min przez 10 minut w temperaturze pokojowej celem uzyskania
surowicy. Po odwirowaniu oddzieloną surowicę i mocz zamrożono w temperaturze -60°C.
Poszczególne etapy przygotowania tkanki, surowicy i moczu do badania z zastosowaniem
spektrometrii mas lub spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego przedstawiono ze
szczegółami w publikacjach.
38
Rozdział 4: Wyniki i dyskusja
4.1 Analiza metabolomiczna tkanki
Monoisotopic silver nanoparticles-based mass spectrometry imaging of human
bladder cancer tissue: Biomarker discovery,Advances in Medical Sciences, 2023,
K. Ossoliński, T. Ruman, T. Ossoliński, A. Ossolińska, A. Arendowski, A. Kołodziej, A.
Płaza-Altamer, J. Nizioł
W publikacji przedstawiono metabolomiczną analizę tkanki nowotworowej pęcherza
moczowego w porównaniu z tkanką prawidłową. Zastosowano metodę obrazowania
LDI-MSI (obrazowanie metodą laserowej desorpcji/jonizacyjnej spektrometrii mas) opartą na
nanocząstkach srebra (109AgNPET) oraz LDI-MS i MS/MS do analizy ekstraktów
tkankowych. Łącznie przeanalizowano materiał pochodzący od 6 pacjentów (pary tkanka
nowotworowa i zdrowa). Analiza danych MSI doprowadziła do identyfikacji 28 związków,
które wykazywały największe zróżnicowanie między obszarami tkanki nowotworowej i
kontrolnej. Wśród nich 2 związki miały wyższą średnią intensywność w tkance
nowotworowej, podczas gdy pozostałe 26 wykazywało wyższą intensywność w prawidłowej
tkance pęcherza moczowego. Wybrane zostały tylko te związki, które wykazywały spójne
trendy we wszystkich 6 eksperymentach.
Dane dotyczące różnic w intensywności zidentyfikowanych związków poddawano
wielowymiarowej analizie statystycznej w tym analizie głównych składowych (PCA) i
ortogonalnej analizie dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów (OPLS-DA), w celu
oceny separacji między obszarami nowotworowymi i normalnymi tkankami. Poprzez
połączenie VIP (>1) z wynikami testu t (wartość p i FDR z testu t <0,05) oraz fold change
(0,5 < FC > 1,2), wybrano 10 metabolitów różnicujących próbki tkanki nowotworowej i
prawidłowej. Metabolity te obejmowały glicynę, hipotaurynę, 3-metylobutanal, etylofosforan,
glutaminę, myosminę, PI(22:0/0:0), aminopentanal, betainę proliny i metyloguanidynę.
Dokładność diagnostyczną wybranych metabolitów oceniono za pomocą analizy krzywej
ROC. Obszary pod krzywymi (AUC) zostały obliczone w celu określenia skuteczności
diagnostycznej metabolitów. Analizy ROC wykazały, że wszystkie wybrane metabolity miały
wartości AUC powyżej 0,81, przy czym hipotauryna i 3-metylobutanal wykazywały
najwyższą wartość AUC = 0,94. Połączenie 10 wybranych metabolitów okazało się lepszym
narzędziem diagnostycznym (AUC = 0,993) niż każdy z metabolitów oddzielnie.
39
4.2 Analiza metabolomiczna surowicy
Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic profiling of blood
serum in bladder cancer. Scientific Reports, 2022
J. Nizioł, K. Ossoliński, A. Płaza-Altamer, A. Kołodziej, A. Ossolińska, T. Ossoliński, T.
Ruman
Badanie miało na celu identyfikację potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego
w surowicy. W niecelowanym badaniu wykorzystano spektrometrię masową o ultrawysokiej
rozdzielczości (UHRMS) i ultra wysokosprawną chromatografię cieczową (UHPLC) w
ekstraktach surowicach od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (BC) i 100 osób z
grupy kontrolnej (NC) z uwzględnieniem stopnia zaawansowania klinicznego i złośliwości
histopatologicznej. Surowice zostały podzielone na dwie grupy: zestaw treningowy
obejmujący 80% wszystkich próbek i zestaw walidacyjny obejmujący pozostałe 20% próbek.
Profilowanie metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie na dwóch zestawach
danych. Zbiór treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów diagnostycznych w
surowicy. Zbiór walidacyjny posłużył do niezależnej walidacji skuteczności diagnostycznej
biomarkerów.
Analiza UHPLC-UHRMS wykazała łącznie 5498 wartości m/z (metabolitów) w treningowym i
walidacyjnym zbiorze danych. Analiza PCA wykazała dobrą separację między surowicami
bazując na ich różnych profilach metabolitów. Nadzorowana analiza statystyczna z
wykorzystaniem OPLS-DA dodatkowo podkreśliła różnice metaboliczne między grupami BC
i NC. Na podstawie wartości VIP (>1) z modelu OPLS-DA i niezależnych testów t (wartość p
i FDR <0,05), zidentyfikowano 1012 zmiennych w zbiorze treningowym i 1052 w zbiorze
walidacyjnym, które uznano za statystycznie istotne. Następnie wyselekcjonowano wspólny
zestaw 864 wartości m/z, 121 wartości m/z przyporządkowano określonym związkom
chemicznym. 85 spośród 121 wybranych metabolitów wykazywało wysokie wartości AUC
(>0,8), co wskazuje na dobrą zdolność dyskryminacyjną między próbkami surowicy
nowotworowej i kontrolnej. Analiza AUC dla kombinacji wykrytych metabolitów okazała się
znakomitym dyskryminatorem próbek surowicy BC vs. NC (AUC >0. 99). Ostatecznie
wybrano 27 metabolitów na podstawie wartości odcięcia FC wynoszących >2 i <0,5.
Aby określić, czy analiza metabolomiczna próbek surowicy może pomóc w rozróżnieniu
między różnymi stopniami złośliwości histopatologicznej, przeprowadzono kolejną serię
analiz PCA i OPLS-DA na grupie treningowej (80 NC, 32 pacjentów z HG i 45 pacjentów z
LG) i walidacyjnej (20 NC, 8 pacjentów z HG i 12 pacjentów z LG). Pacjentów z PUNLMP
wykluczono z analizy. Analiza wykazała dobrą dyskryminację między grupami kontrolnymi i
nowotworowymi z rozróżnieniem na raka low-grade (LG) i high grade (HG) zarówno w
zestawach treningowych, jak i walidacyjnych. Modele nie były jednak w stanie w
statystycznie istotny sposób odróżnić surowice pochodzących od pacjentów z
nowotworami LG vs HG. Zidentyfikowano znaczną liczbę wartości m/z , które w isotny
statystycznie sposób rozróżniały pomiędzy poszczególnymi stopniami złośliwości
histopatologicznej a grupą kontrolną (1500 dla HG BC vs. NC i 1600 dla LG BC vs NC). 138
i 148 wartości m/z dla grup HG BC vs. NC i LG BC vs. NC zostało powiązanych z
40
określonymi związkami chemicznymi. Ponadto analizy krzywej ROC wykazały dobrą
wydajność diagnostyczną modeli, przy wartościach AUC >0,75 dla pięciu metabolitów, co
wskazuje na wysoki poziom dokładności. Ostatecznie wyselekcjonowano 23 potencjalne
biomarkery dla podgrup LG i HG BC z wartościami FC >2 i <0,5.
W badaniu przeprowadzono także analizę surowicy w zależności od stopnia zaawansowania
klinicznego. Stadia obejmowały nieinwazyjnego raka brodawczakowatego (pTa), raka
naciekającego podnabłonkową tkankę łączną (pT1) i raka naciekającego błonę mięśniową
(pT2), z łącznie 69 próbkami dla pTa, 19 dla pT1 i 12 dla pT2. Wyniki analizy głównych
składowych (PCA) i ortogonalnej analizy dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów
(OPLS-DA) wykazały dobrą separację między kontrolnymi surowicami (NC) a
poszczególnymi stadiami BC. Nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic
przy analizie porównawczej trzech grup stadiów raka względem siebie (pTa vs. pT1 vs.
pT2). Dalsza analiza modelu OPLS-DA, obejmująca analizę FC i VIP, ujawniła szereg
wartości m/z najbardziej istotnych w rozróżnieniu próbek. Obejmowały one 63 wartości m/z
dla pTa BC vs NCs, 66 wartości m/z dla pT1 BC vs. NCs i 69 wartości m/z dla pT2 BC vs.
NCs. Analiza krzywej ROC pozwoliła na zidentyfikowanie 37 potencjalnych biomarkerów z
wartościami FC >2 i <0,5, czułością i swoistością wynoszącą odpowiednio 74% i 62%.
Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical Analysis, 2022
K. Ossoliński, T. Ruman, V. Copié, B.P. Tripet, L. B. Nogueira, K.O.P.C. Nogueira, A.
Kołodziej, A. Płaza-Altamer, A. Ossolińska, T. Ossoliński, J. Nizioł
Badanie dotyczyło analizy 200 próbek surowicy uzyskanych od 100 pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego (BC) i 100 zdrowych osób (NC), z wykorzystaniem celowanego i
niecelowanego podejścia profilowania metabolomicznego. Zastosowane techniki analityczne
obejmowały wysokiej rozdzielczości 1H NMR, spektrometria atomowa emisyjna z indukcyjnie
sprzężoną plazmą (ICP-OES) i wysokiej rozdzielczości laserową desorpcję/jonizację MS
(LDI-MS) opartą na nanocząstkach złota i srebra (PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS oraz
PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS).
ICP-OES (Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy - spektrometria
emisyjna z indukcyjnie sprzężonym plazmą) to technika analityczna stosowana do analizy
składu pierwiastkowego próbek [45]. Jest to metoda spektroskopii emisyjnej, która
wykorzystuje zjawisko jonizacji w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP) oraz pomiar emisji
światła przez jonizowane pierwiastki. Próbka wprowadzana jest do indukcyjnie sprzężonej
plazmy w postaci aerozolu. Wysoka temperatura plazmy powoduje rozpad próbki na
atomy składowe, które następnie zostają wzbudzone i emitują światło o
charakterystycznych długościach fal. Mierząc intensywność tego światła, można określić
stężenie pierwiastków w próbce. W kontekście metabolomiki, a dokładnie elementomiki,
ICP-OES może być szczególnie przydatna do wykrywania i ilościowego oznaczania jonów
metali i innych pierwiastków zaangażowanych w różne procesy biochemiczne.
41
PFL-2D GS LASiS to udoskonalona metoda generowania nanocząstek opracowana przez
zespół T. Rumana polegająca na zastosowaniu do generowania nanocząstek lasera
światłowodowego z galwoskanerem 2D która jest połączona jest z laserową
jonizacją/desorpcją wspomaganą nanocząstkami złota (AuNPs) i srebra (109AgNPs).
Surowice zostały podzielone na dwie grupy: zestaw treningowy obejmujący 80% wszystkich
próbek (n=80) i zestaw walidacyjny obejmujący pozostałe 20% próbek (n=20). Profilowanie
metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie na obu zestawach danych. Zbiór
treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów diagnostycznych w surowicy.
Zbiór walidacyjny posłużył niezależnej walidacji skuteczności diagnostycznej biomarkerów.
200 ekstraktów surowicy (100 od pacjentów z rakiem i 100 z grupy kontrolnej) poddanych
zostało analizie NMR, identyfikując 39 różnych związków w każdej próbce. Dwa metabolity,
3-hydroksymaślan i octan, wykazywały statystycznie znaczące różnice w stężeniu między
grupą chorych na raka i grupą kontrolną. Poziomy 3-hydroksymaślanu były znacznie wyższe
u pacjentów z rakiem, podczas gdy poziomy octanu były zauważalnie niższe. Następnie,
zebrane dane dotyczące metabolitów zostały podzielone na dwie grupy: treningowy zbiór
danych (80 pacjentów z rakiem i 80 kontroli) - w celu opracowania modelu oraz walidacyjny
zbiór danych (20 pacjentów z rakiem i 20 kontroli) - w celu oceny wydajności modelu.
Analiza głównych składowych (PCA) wykazała dobrą separację między grupami
nowotworowymi i kontrolnymi w obu zestawach danych. Następnie zastosowano analizę
OPLS-DA celem szkolenia modelu na zidentyfikowanych metabolitach. Model wykazał silną
separację między grupami nowotworowymi i kontrolnymi. Dalsza analiza modelu OPLS-DA
ujawniła szereg metabolitów o istotnej korelacji z separacją grup. Metabolity, takie jak octan,
propionian, piroglutaminian i cholina, wykazywały dodatnie korelacje, podczas gdy
izomaślan - ujemną. W zestawie walidacyjnym wszystkie metabolity poza piroglutaminianem
wykazały istotność w zdolności do rozróżniania między grupami. Następnie przeprowadzono
analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) na zestawach treningowych i
walidacyjnych w celu oceny potencjału diagnostycznego wybranych metabolitów. Wszystkie
cztery metabolity (octan, propionian, cholina i izomaślan) wykazywały wysokie wartości AUC
(>0,82), przy czym izomaślan okazał się najbardziej znaczącym biomarkerem, uzyskując
najwyższe wyniki w zakresie AUC (>0,953), swoistości (0,9) i czułości (0,9). Następnie
skonstruowano model klasyfikacji ROC, zbudowany przy użyciu MetaboAnalyst 5.0 oparty
na algorytmie random forest. Podejście to obejmowało połączone poziomy tych czterech
metabolitów, okazując się lepszym dyskryminatorem (z AUC >0,999) niż każdy metabolit
osobno.
W celu ustalenia czy analiza metabolomiczna NMR może rozróżnić surowice z
pochodzącymi od pacjentów z nowotworami z różnymi stopniami złośliwości
histopatologicznej, przeprowadzono analizy PCA i OPLS-DA na całym zbiorze danych
metabolitów. Analiza obejmowała 95 próbek surowicy od pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego; wykluczono 3 próbki od pacjentów z PUNLMP i 2 próbki od pacjentów z guzem
mieszanym HG + LG. Ostatecznie wykorzystano 41 ekstraktów surowicy od pacjentów z
rakiem HG i 54 próbki od pacjentów z rakiem LG. Zarówno analiza PCA jak i OPLS-DA
wykazały niewielką, ale statystycznie istotną separację pomiędzy grupami LG vs. HG.
Następnie zidentyfikowano 15 następujących metabolitów przyczyniających się do tej
niewielkiej separacji: leucyna, histydyna, alanina, 3-metylo-2-oksowalerianian, tyrozyna,
42
fenyloalanina, cholina, tryptofan, hipoksantyna, asparagina, walina, prolina, treonina,
2-hydroksymaślan i glutamina. Dalsza analiza ROC dla każdego metabolitu z osobna
pozwoliła na selekcję 5 (leucyna, histydyna, alanina, 3-metylo-2-oksowalerianian i tyrozyna)
o wartościach AUC większej niż 0,74. Następnie wyliczono AUC dla modelu opartego na
połączeniu 5 wyselekcjonowanych metabolitów, które wynosiło 0,775.
Przeanalizowano również różnicę w profilach metabolicznych w zależności od stopnia
zaawansowania klinicznego z zastosowaniem NMR. Uwzględniono łącznie 88 próbek od
pacjentów z rakiem nienaciekającym mięśniówki - NMIBC (pTa/pT1) i 12 próbek od
pacjentów z rakiem naciekającym mięśniówkę - MIBC (pT2). Wykresy PCA i OPLS-DA
wykazały niewielką ale statystycznie istotną separację między pTa/pT1 a pT2 BC.
Wyselekcjonowano 12 metabolitów istotnych w różnicowaniu między stopniami
zaawansowania raka pTa/pT1 i pT2: histydyna, alanina, tryptofan, glutamina, glicyna,
metylohistydyna, cholina, izomaślan, treonina, fenyloalanina, leucyna i
3-metylo-2-oksowalerianian. Wszystkie miały wyższe stężenia w surowicach pTa/pT1.
Dalsza analiza krzywej ROC pozwoliła na zawężenie listy do 9 metabolitów (histydyna,
alanina, tryptofan, glutamina, glicyna, metylohistydyna, cholina, izomaślan i treonina), które
wykazały największą zdolność dyskryminacyjną (AUC większe niż 0,75). Następnie
obliczono nowe AUC dla tego udoskonalonego modelu (który teraz uwzględniał tylko te 9
metabolitów) - wynosiło 0,844. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w profilu
metabolicznym pomiędzy surowicami pTa vs. pT1 vs. pT2.
Dalsza analiza obejmowała badanie z zastosowaniem ICP-OES 116 próbek surowicy - 65
surowic nowotworowych i 51 kontrolnych. Określono stężenie łącznie dla 12 pierwiastków.
Dane z analizy surowicy zostały podzielone losowo na dwa zestawy: treningowy (42
surowice kontrolne i 52 surowice nowotworowe) oraz walidacyjny (10 surowic kontrolnych i
13 surowic nowotworowych). Wykres PCA ujawnił tendencję do oddzielania obu grup w
zestawie treningowym. Z kolei analiza OPLS-DA pozwoliła na nieco lepsze zróżnicowanie
między pacjentami z rakiem a osobami kontrolnymi. Trzy pierwiastki - Cu, Fe, Li - wyróżniły
się w rozróżnianiu grup badawczych. Po przeprowadzeniu walidacji modelu, tylko Cu i Fe
zostały uznane za znaczące dyskryminatory obu grup. Wykres S analizy OPLS-DA dla
zestawu treningowego pokazał, że Fe był ujemnie skorelowany z rozdzielaniem grup
(P(corr)[1] <0,5), co wskazuje na znacznie wyższe stężenie tego pierwiastka w surowicy
pacjentów z BC w porównaniu z grupą kontrolną. Li natomiast wykazał dodatnią korelację z
rozdzielaniem grup (P(corr)[1] >0,5), co sugeruje wyższe stężenie tego pierwiastka w
próbkach surowicy osób kontrolnych. Analiza ROC wskazała Fe jako najbardziej znaczący
pierwiastek, z wartością AUC wynoszącą 0,850, czułością 0,8 i swoistością 0,8. Dla Li
wartość AUC wyniosła 0,710, czułość - 0,8, a swoistość - 0,6. Wydajność modelu ICP-OES
w rozróżnianiu próbek rakowych od kontrolnych oceniono na podstawie tych dwóch
wybranych pierwiastków (Fe i Li). Model wykazał wartość AUC wynoszącą 0,807, co
sugeruje dobrą moc dyskryminacyjną między grupą BC i NC.
Analizę surowicy z zastosowaniem LDI-MS przeprowadzono na 100 surowicach
nowotworowych i 100 surowicach kontrolnych. W tym celu zastosowano dwie metody
analityczne: PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS i PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS, co
pozwoliło na identyfikację odpowiednio 335 i 650 wartości m/z. Zebrane dane poddano
analizie statystycznej, dzieląc je na dwa podzbiory: treningowy, zawierający 160 próbek (80
od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego (BC), 80 od osób zdrowych (NC)),
43
oraz walidacyjny składający się z 40 próbek (20 BC i 20 NC). Zastosowanie metod 2D-PCA i
OPLS-DA dla danych uzyskanych za pomocą analizy 109AgNPs LDI-MS pozwoliło na
wyraźne rozróżnienie między próbkami surowicy od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza
moczowego i grupy kontrolnej w obu podzbiorach. Udało się zidentyfikować 216 wspólnych
cech m/z. Spośród nich 96 wartości m/z było obecnych w większej ilości w surowicy
pacjentów z BC, natomiast 119 cech prezentowało odwrotną tendencję. Co istotne,
połączenie wartości m/z okazało się lepszym dyskryminatorem pomiędzy grupami BC i NC
(AUC >0.99) niż niezależna ocena każdej cechy m/z (AUC >0,73). Następnie,
zidentyfikowane cechy widma masowego porównano z bazami danych metabolitów, co
umożliwiło domniemaną identyfikację 17 naturalnie występujących w organizmie człowieka
metabolitów. Podobne wyniki przyniosła analiza danych uzyskanych za pomocą techniki
PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS. W tym przypadku również zaobserwowano wyraźne
różnice między surowicą od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego a surowicą
od osób zdrowych przy zastosowaniu analizy PCA i OPLS-DA. Analiza pozwoliła na
identyfikację 172 wspólnych cech. Spośród nich 44 wartości m/z były obecne w większej
ilości w surowicy od osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego, podczas gdy 128
cech prezentowało odwrotną tendencję. Tak jak w poprzednim przypadku, bardziej
efektywne okazało się wykorzystanie połączonej oceny cech widma masowego (AUC
>0.99), w porównaniu z wartościami AUC pojedynczych metabolitów. Kolejno
zidentyfikowane cechy widma masowego porównano z bazami danych metabolitów, co
umożliwiło identyfikację 8 metabolitów występujących w organizmie człowieka.
44
4.3 Analiza metabolomiczna moczu
Untargeted urinary metabolomics for bladder cancer biomarker screening with
ultrahigh-resolution mass spectrometry.Scientific Reports, 2023.
J. Nizioł, K. Ossoliński, A. Płaza-Altamer, A. Kołodziej, A. Ossolińska, T. Ossoliński, A.
Nieczaj, T. Ruman
Badanie miało na celu analizę metabolomiczną moczu na potrzby poszukiwania
potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego. Do analizy użyto spektrometrii mas
o ultra0wysokiej rozdzielczości (UHRMS) w połączeniu z ultra-wysokosprawną
chromatografią cieczową (UHPLC) na próbkach moczu pobranych od 100 chorych na raka
pęcherza moczowego (BC) oraz 100 osób z grupy kontrolnej (NC), uwzględniając stopień
zaawansowania klinicznego i stopień złośliwości histopatologicznej. Próbki moczu
podzielono na dwie części: zestaw treningowy zawierający 70% wszystkich próbek oraz
zestaw walidacyjny z pozostałymi 30%. Metaboliczne profilowanie moczu wykonano
oddzielnie dla obu zestawów. Zestaw treningowy posłużył do wykrycia biomarkerów
diagnostycznych w moczu, natomiast zestaw walidacyjny wykorzystano do niezależnego
potwierdzenia skuteczności wykrytych biomarkerów.
Analiza spektrometryczna wykazała łącznie 2969 wartości m/z (metabolitów) w
treningowym i walidacyjnym zbiorze danych. Analiza PCA wykazała dobrą separację między
pacjentami z rakiem a grupą kontrolną bazując na różnych profilach metabolitów.
Nadzorowana analiza wielowymiarowa z wykorzystaniem OPLS-DA dodatkowo podkreśliła
różnice metaboliczne między grupami BC i kontrolnymi. Kolejne testy permutacyjne
potwierdziły dokładność modelu OPLS-DA. Następnie przeprowadzono analizę ROC,
zarówno na zestawach treningowych, jak i walidacyjnych, aby ocenić zdolność
diagnostyczną modeli. Powierzchnia pod krzywą ROC (AUC) została wykorzystana do
analizy czułości i swoistości biomarkerów. Na podstawie wartości AUC >0,7 w połączeniu z
VIP >1 z modelu OPLS-DA i niezależnych testów t (wartość p i FDR <0,05), wybrano 464
zmienne w zbiorze treningowym i 548 zmiennych w zbiorze walidacyjnym, które uznano za
istotne.
Następnie wyselekcjonowano wspólny zestaw 51 wartości m/z, z czego 20 udało się
przyporządkować określonym związkom chemicznym. 5 z 51 wybranych metabolitów
wykazywało bardzo wysokie wartości AUC (>0,9), co wskazuje na doskonałą zdolność
dyskryminacyjną między próbkami moczu pochodzącego od pacjentów z nowotworem i
kontrolnych. Połączenie metabolitów z zestawu treningowego i walidacyjnego świetnie
różnicuje pomiędzy grupami BC vs. NC, z AUC > 0,979.
Dodatkowe analizy PCA i OPLS DA zostały wykonane na zbiorach danych treningowych (70
NC, 30 pacjentów z HG i 38 pacjentów z LG) oraz walidacyjnych (30 NC, 12 pacjentów z HG
i 17 pacjentów z LG). Miały na celu zweryfikowanie, czy badanie metabolomiczne próbek
moczu mogłoby służyć do rozróżniania stopni złośliwości histopatologicznej. Z analizy
wyłączono pacjentów z PLUMP z powodu ich niewielkiej liczebności. W ramach zestawów
treningowych i walidacyjnych, wykresy wyników PCA i OPLS-DA ujawniły wyraźną separację
45
pomiędzy grupami kontrolnymi a grupami nowotworowymi o różnym stopniu złośliwości
histopatologicznej (LG vs. NC i HG vs. NC). Kolejne testy permutacyjne potwierdziły
dokładność modelu OPLS-DA. Niemniej jednak na wykresie PCA nie zaobserwowano
znaczących różnic pomiędzy pacjentami z LG vs. HG. W modelu OPLS-DA
porównującym LG BC z NC, uznano 26 wykrytych związków chemicznych za znaczące (VIP
>1, wartość p <0,05) zarówno w zestawie treningowym, jak i walidacyjnym, zaś do analizy
porównującej HG BC z NC wyselekcjonowano 63 związki spełniające te kryteria. 2 z 26
metabolitów w modelu LG vs. NC i 13 z 63 w modelu HG vs. NC miały wartości AUC
powyżej 0,9.
Aby zidentyfikować różnice pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego raka pęcherza
moczowego, stworzono modele PCA i OPLS-DA. 68 próbek moczu od pacjentów z pTa BC
podzielono na grupy treningowe (70 NC, 47 pTa BC) i walidacyjne (30 NC, 21 pTa BC). 19
próbek moczu od pacjentów z pT1 BC również podzielono na grupy treningowe (70 NC, 15
pT1 BC) i walidacyjne (30 NC, 5 pT1 BC). W przypadku stadium pT2 BC ze względu na
małą liczbę próbek przeprowadzono analizę bez podziału grupy treningowe i walidacyjne (30
NC, 12 pT2 BC). Wykresy wyników PCA i OPLS-DA wykazały wyraźną separację między
NC a poszczególnymi stadiami BC (pTa vs. NC, pT1 vs. NC, i pT2 vs. NC). Testy permutacji
potwierdziły duże zróżnicowanie profili metabolitów między tymi grupami. Skuteczność
trzech modeli w różnicowaniu pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego pTa, pT1 i
pT2 oraz NC oceniono za pomocą analizy krzywej ROC. Opierając się na kryteriach odcięcia
(FC >2 lub <0,5, VIP >1; AUC >0.7, wartość p i FDR <0,05) wyselekcjonowano kolejno 19,
68 i 81 związków chemicznych, które najlepiej rozróżniały próbki moczu pomiędzy stadiami
pTa BC vs. NC, pT1 BC vs. NC i pT2 BC vs. NC. Porównanie trzech stopni
zaawansowania nowotworu pomiędzy sobą (pT1 vs. pTa vs. pT2) nie wykazało
istotnych różnic statystycznych.
Targeted and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer. Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2023
K. Ossoliński, T. Ruman, V. Copié, B.P. Tripet, A. Kołodziej, A. Płaza-Altamer, A.
Ossolińska, T. Ossoliński, A. Nieczaj, J. Nizioł
W niniejszej pracy zbadano profile metabolitów 200 próbek moczu uzyskanych od 100
pacjentek z rakiem pęcherza moczowego (BC) i 100 zdrowych osób (NC), z wykorzystaniem
celowanego i niecelowanego podejścia profilowania metabolomicznego. Zastosowane
techniki analityczne obejmowały wysokiej rozdzielczości 1H NMR oraz spektrometrię mas
opartą na nanocząstkach złota i srebra generowanych laserowo (PFL-2D GS LASiS AuNPs
LDI-MS oraz PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS). Do analizy statystycznej danych NMR
wykorzystano 99 próbek moczu. W przypadku jednej próbki nie można było uzyskać
odpowiednio wysokiej jakości widm NMR. Próbki moczu zostały podzielone na dwie grupy,
zestaw treningowy, obejmujący n = 70 próbek BC i NC oraz zestaw walidacyjny obejmujący
pozostałe n=30 BC i NC. Profilowanie metaboliczne surowicy przeprowadzono niezależnie
na obu zestawach danych. Zbiór treningowy został wykorzystany do identyfikacji markerów
diagnostycznych w moczu. Zbiór walidacyjny posłużył niezależnej walidacji skuteczności
diagnostycznej biomarkerów.
46
Analiza próbek moczu z zastosowaniem 1H NMR o wysokiej rozdzielczości pozwoliła na
zidentyfikowanie 39 metabolitów, które wykazywały znaczące różnice w stężeniach między
próbkami BC i NC. Zebrane dane NMR podzielono na podzbiory treningowe i walidacyjne w
celu skutecznej budowy i weryfikacji modelu. Analiza głównych składowych (PCA) obu
zestawów danych wykazała wyraźną separację między grupami BC i NC. Następnie
przeprowadzono analizę OPLS-DA na potrzeby zbadania zakresu różnic metabolicznych
między grupami BC i NC, w wyniku której uzyskano znaczącą separację grup w obu
zestawach danych. Analiza krzywej ROC wraz z określeniem VIP została przeprowadzona
na obu zestawach w celu oceny skuteczności diagnostycznej modeli OPLS-DA.
Wyselekcjonowano odpowiednio 15 i 16 metabolitów w zestawie treningowym i
walidacyjnym na podstawie połączonej analizy wyników VIP (> 1,), testów t (wartości p i
FDR <0,05) oraz analizy powierzchni pod krzywą ROC (AUC >0,7). 12 z nich powtarzało się
w obydwu zestawach. Ostatecznie 5 metabolitów zostało zidentyfikowanych jako istotne na
podstawie parametru FC >2 lub <0,5 (trygonelina, hipuran, mocznik, mannitol i
4-hydroksyfenylooctan). Potencjał diagnostyczny tych 5 metabolitów oceniono za pomocą
analiz krzywej ROC i modelowania random forest, które wykazały wysoki potencjał
dyskryminacji (AUC >0,828) między dwiema grupami w obydwu zestawach danych.
Najbardziej obiecujące wyniki zaobserwowano dla trygoneliny, mocznika, mannitolu i
4-hydroksyfenylooctanu, z których wszystkie osiągnęły wartości AUC większe niż 0,8.
Celem identyfikacji metabolitów rozróżniających pomiędzy stopniem złośliwości
histopatologicznej zastosowano analizę statystyczną, która obejmowała PCA, OPLS-DA i
jednokierunkowe analizy ANOVA zarówno na zestawach danych treningowych, jak i
walidacyjnych. Pula próbek składała się z 95 próbek moczu od pacjentów z rakiem o
wysokim stopniu złośliwości (HG) i niskim stopniu złośliwości (LG), z wyłączeniem próbek od
pacjentów z brodawkowatym nowotworem urotelialnym o niskim potencjale złośliwości
(PUNLMP). Zbiory danych treningowych i walidacyjnych zostały wykorzystane odpowiednio
do trenowania i walidacji modelu PCA. Zestaw treningowy składał się z 29 próbek HG, 36
LG i 69 NC, podczas gdy zestaw walidacyjny zawierał 11 próbek HG, 18 próbek LG i 30 NC.
Zarówno w zestawie treningowym, jak i walidacyjnym, wykresy wyników PCA i OPLS-DA
wykazały separację między grupami kontrolnymi i nowotworowymi (LG BC vs. NC i HG BC
vs. NC). Rozróżnienie pomiędzy LG vs HG na wykresie PCA było jedynie marginalne
(nieistotne statystycznie). Trzy metabolity, a mianowicie trygonelina, hipuran i mannitol,
okazały się statystycznie istotne (VIP > 1, wartość p, FDR 0,05, FC <0,5 lub >2, AUC >0,7)
w modelu OPLS-DA dla grup LG BC vs. NC oraz HG BC vs. NC, zarówno w zestawie
treningowym jak i walidacyjnym. Chociaż nienadzorowana analiza PCA nie zdołała rozróżnić
grup na podstawie różnych stopni złośliwości histopatologicznej (LG vs. BC), z
powodzeniem rozróżniała nowotworowe i kontrolne próbki moczu.
Następna analiza z zastosowaniem NMR posłużyła do próby identyfikacji metabolitów
rozróżniających pomiędzy stopniami zaawansowania klinicznego. W tym, celu zastosowano
analizę statystyczną, która obejmowała PCA, OPLS-DA i jednokierunkowe analizy ANOVA
zarówno na zestawach danych treningowych, jak i walidacyjnych.
47
Zbiór danych obejmował próbki moczu od 87 pacjentów z nieinwazyjnym rakiem pęcherza
moczowego - NMIBC (pTa i pT1) oraz 12 pacjentów z naciekającym mięśniówkę rakiem
pęcherza moczowego - MIBC (pT2). Zostały one podzielone na zestaw treningowy (n=48
pTa i n=69 NC) i zestaw walidacyjny (n=20 pTa i n=30 NC). Ze względu na ograniczoną
liczbę próbek w przypadku stadiów pT1 (n=34) i pT2 (n=12) analiza przeprowadzono jako
jeden zestaw, bez podziału na treningowy i walidacyjny. Wykresy wyników PCA i OPLS-DA
wykazały dobrą separację między próbkami kontrolnymi (NC) a różnymi stadiami BC (pTa
vs. NC, pT1 vs. NC i pT2 vs. NC). Analiza krzywej ROC dodatkowo potwierdziła
skuteczność modeli w rozróżnianiu stadiów pTa, pT1 i pT2 BC i NC. Bazując na ustalonych
kryteriach odcięcia (FC >2 lub <0,5, VIP >1; AUC 0,7, wartość p i FDR <0,05),
wyselekcjonowano metabolity mające największe znaczenie dla rozróżnienia między
grupami pTa BC vs. NC (6 metabolitów), pT1 BC vs. NC (10 metabolitów) oraz pT2 BC vs.
NC (7 metabolitów). W badaniu nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic
we wzorcach metabolitów, które mogłyby odróżnić między sobą trzy stopnie
zaawansowania klinicznego (pT1 vs. pTa vs. pT2).
Analiza metabolomiczna próbek moczu z zastosowaniem LDI-MS obejmowała metody
PFL-2D GS LASiS AuNPs i PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS. Do analizy wykorzystano
200 próbek moczu. Łącznie uzyskano 690 cech MS różnicujących grupy. Zbiór danych
został podzielony na zestaw treningowy (n=70 BC i n=70 NC) i zestaw walidacyjny (n=30 BC
i n=30 NC). Zarówno analizy PCA, jak i OPLS-DA doprowadziły do wyraźnej separacji
między grupą z rakiem pęcherza moczowego a grupą kontrolną na podstawie ich profili
metabolitów w moczu. Aby zidentyfikować najbardziej dyskryminujące cechy widma
masowego między grupami BC i NC, wybrano metabolity charakteryzujące się wartością VIP
>1 z modelu OPLS-DA.
● Analiza PFL-2D GS LASiS 109AgNPs LDI-MS
Zidentyfikowano 74 cechy widma masowego (m/z) wspólne dla zbiorów danych
treningowych i walidacyjnych, które spełniały określone kryteria (wartość VIP >1, wartość p
<0,05, FC <0,5 lub >1,8 oraz AUC >0,7). Dalszą analizę eksploracyjną ROC, opartą na
algorytmie random forest, przeprowadzono w celu zidentyfikowania najbardziej
dyskryminujących cech spektralnych m/z między grupami BC i kontrolnymi. 50-cechowy
panel w zestawie treningowym i 100-cechowy panel w zestawie walidacyjnym wykazały
doskonałą siłę dyskryminacji (AUC >0,97).
● Analiza PFL-2D GS LASiS PFL-2D GS LASiS AuNPs
W analizie obu podzbiorów (treningowyego i walidacyjnego) znaleziono 98 wspólnych cech z
wynikami VIP >1,, wartością p <0,05, FC <0,5 lub >1,8 i AUC >0,7. Spośród nich, 49 było
bardziej obfitych w próbkach moczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego, a 49 cech
wykazywało odwrotną tendencję. Identyfikację przypuszczalnych związków wybranych cech
widma masowego przeprowadzono poprzez porównanie obserwowanych cech widmowych
ze związkami obecnymi w bazach danych metabolitów. 25cech widma masowego
przypisano do metabolitów występujących u ludzi.
48
Podsumowanie i wnioski
Badanie pt. "Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w poszukiwaniu
potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego" miało na celu identyfikację
biomarkerów raka pęcherza moczowego poprzez przeprowadzenie kompleksowego
profilowania metabolomicznego próbek surowicy, moczu i tkanek. Według wiedzy autora jest
to jedyne badanie łączące analizę zarówno wszystkich dostępnych próbek biologicznych jak
i wszystkie dostępne metody analizy stosowanej w metabolomice. Obejmowało ono
zaawansowane techniki, takie jak spektrometra mas, NMR do analizy profilu
metabolomicznego raka pęcherza moczowego i rzadko stosowana metoda ICP-OES do
analizy profilu elementomicznego. Badanie wykazało odmienne profile metabolomiczne
pomiędzy pacjentami z rakiem pęcherza moczowego a grupą kontrolną. Zidentyfikowano
metabolity, które na podstawie analizy statystycznej wykazują potencjał jako możliwe
biomarkery diagnostyczne raka pęcherza moczowego.
Wyniki badania torują drogę do lepszego zrozumienia zmian metabolicznych związanych z
rakiem pęcherza moczowego. Zidentyfikowane metabolity stanowią obiecujący kierunek
rozwoju nieinwazyjnych narzędzi diagnostycznych i prognostycznych mogących poprawić
wczesne wykrywanie raka pęcherza moczowego i wyniki jego leczenia. Konieczne są jednak
dalsze badania walidacyjne w celu potwierdzenia tych ustaleń w większych i bardziej
zróżnicowanych kohortach pacjentów.
Mocne strony badania:
- Kompleksowe podejście. W badaniu zastosowano kompleksowe podejście
metabolomiczne i elementomiczne, badając próbki surowicy, moczu i tkanek,
zapewniając w ten sposób całościowy obraz zmian metabolicznych zachodzących w
raku pęcherza moczowego.
- Zaawansowane techniki. Zastosowanie zaawansowanych technik analitycznych (MS,
NMR i ICP-OES) ułatwiło wykrycie i identyfikację szerokiego zakresu metabolitów,
zwiększając szanse na znalezienie potencjalnych biomarkerów.
- Analiza ścieżek. Analiza zmienionych szlaków metabolicznych, a nie tylko
poszczególnych metabolitów, zapewnia głębsze zrozumienie mechanizmu choroby i
może pomóc w opracowaniu ukierunkowanych terapii.
- Potencjał dla testów nieinwazyjnych. Biorąc pod uwagę charakter zidentyfikowanych
biomarkerów, istnieje możliwość opracowania nieinwazyjnych testów do
diagnozowania i monitorowania raka pęcherza moczowego, co może poprawić
dokładność diagnostyczną, obniżyć koszty diagnostyki i monitorowania pacjentów z
rakiem pęcherza moczowego, jednocześnie zwiększając komfort i przestrzeganie
zaleceń przez pacjentów.
49
W publikacji pt. “Monoisotopic silver nanoparticles-based mass spectrometry imaging
of human bladder cancer tissue: Biomarker discovery” przeanalizowano fragmenty
tkanek pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego. Poza zidentyfikowaniem
poszczególnych metabolitów rozróżniających tkankę nowotworową i kontrolną
przeanalizowano dodatkowo szlaki metaboliczne, w których występują, oraz określono ich
związek z nowotworzeniem. Analiza ujawniła wyraźne różnice między nowotworową a
prawidłową tkanką pęcherza moczowego, wskazując na potencjał tych metabolitów jako
markerów diagnostycznych raka pęcherza moczowego. Lipidy odegrały znaczącą rolę wśród
zidentyfikowanych biomarkerów, odzwierciedlając ich zaangażowanie w różne procesy
komórkowe oraz podkreślając znaczenie w metabolizmie nowotworów i szlakach
sygnałowych. Aminokwasy, takie jak glicyna i glutamina, wykazywały obniżone poziomy w
tkance nowotworowej, co sugeruje ich potencjał jako wskaźników metabolizmu guza
poprzez zwiększone zapotrzebowanie w procesie proliferacji komórek nowotworowych. Inne
metabolity z różnych klas chemicznych, w tym aldehydy, osmoprotektanty i związki
organiczne, zostały również zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery. Integracja
wielowymiarowej analizy statystycznej pozwoliła na kompleksową ocenę potencjału
diagnostycznego zidentyfikowanych metabolitów. Wykazano również, że wartość AUC dla
grupy metabolitów jest wyższa niż każdego z nich oddzielnie, wskazując na znaczenie
uwzględnienia grupy metabolitów celem poprawy ich dokładności diagnostycznej. Wysokie
wartości AUC uzyskane z analizy ROC sygnalizują na potencjalną użyteczność kliniczną
tych metabolitów jako narzędzi diagnostycznych w przypadku raka pęcherza moczowego,
mających potencjał choćby do wspomagania analizy histopatologicznej - zastosowanie
metody obrazowania LDI-MSI pozwoliło na graficzne zobrazowanie w przestrzeni
dwuwymiarowej rozkładu poszczególnych metabolitów.
W publikacjach pt. “Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic
profiling of blood serum in bladder cancer.” oraz “Metabolomic and elemental
profiling of blood serum in bladder cancer.” przeanalizowano surowice pochodzące od
pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz surowice kontrolne. W pierwszej publikacji
zastosowano ultra-wysokowydajną chromatografię cieczową (UHPLC) połączoną z
ultra-wysokorozdzielczą spektrometrią mas (UHRMS) do niecelowanego profilowania
metabolomicznego 200 próbek ludzkiej surowicy, aby zidentyfikować sygnatury
biochemiczne różnicujące raka pęcherza moczowego od surowic kontrolnych. Jedno- i
wielozmiennowe analizy statystyczne z zewnętrzną walidacją wykazały 27 metabolitów
różnicujących surowice pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza i kontrolne. Obfitość
tych metabolitów wykazywała istotne różnice statystyczne w dwóch niezależnych zestawach
szkoleniowych i walidacyjnych. Zidentyfikowano również 23 metabolity różnicujące surowice
pochodzące od pacjentów z rakiem o niskim i wysokim stopniu złośliwości histopatologicznej
w porównaniu z surowicami kontrolnymi. 37 metabolitów w surowicy różnicowało odmienne
stadia zaawansowania klinicznego BC w porównaniu z surowicami kontrolnymi. Nie
stwierdzono jednak statystycznie istotnych różnic w profilach metabolicznych w analizie
porównawczej pomiędzy poszczególnymi stopniami złośliwości histopatologicznej i
zaawansowania klinicznego. Poza zidentyfikowaniem poszczególnych metabolitów
przeanalizowano również szlaki metaboliczne, w których dane związki występują, oraz
określono ich korelację z nowotworzeniem. Wyniki sugerują, że pomiar metabolitów w
surowicy z zastosowaniem spektrometrii może zapewnić dokładną i mało inwazyjną metodę
diagnostyczną do wykrywania raka pęcherza moczowego.
50
W publikacji pt. “Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder
cancer” wykazano, że kompleksowy zestaw narzędzi obejmujący NMR o wysokiej
rozdzielczości, ICP-OES i LDI-MS w połączeniu z wielowymiarową analizą statystyczną jest
potężnym narzędziem do analizy zmian metabolomicznych i elementomicznych
zachodzących w raku pęcherza moczowego. W kontekście identyfikacji biomarkerów za
pomocą spektroskopii 1H NMR, zidentyfikowano 4 potencjalne biomarkery metaboliczne,
które wykazały potencjał predykcyjny z AUC >0,999 do rozróżniania surowicy nowotworowej
z kontrolną. Zaobserwowano również, że stężenia żelaza i litu różniły się znacząco w
surowicy zdrowych osób w porównaniu z pacjentami z rakiem pęcherza moczowego. Co
więcej, wyniki LDI-MS ujawniły 22 związki, głównie (glikosfingo)lipidy, które mogą
różnicować próbki nowotworowe i kontrolne. Wyselekcjonowano 5 metabolitów, które mogą
potencjalnie służyć jako biomarkery do rozróżniania raka pęcherza moczowego o niskim
stopniu złośliwości (LG) i raka pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości (HG), a
także 9 metabolitów, które mogą pomóc w rozróżnieniu stadiów zaawansowania choroby
pTa/pT1 (NMIBC) i pT2 (MIBC). Nie stwierdzono jednak istotnych statystycznie różnic w
profilu metabolicznym pomiędzy surowicami pTa vs. pT1 vs. pT2. Wyniki te podkreślają
znaczenie zróżnicowanych profili metabolitów w surowicy nie tylko w procesie rozróżniania
surowicy od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (BC) od surowicy zdrowych osób
(NC), ale także w kontekście zdolności do rozróżniania pomiędzy rakiem NMIBC i MIBC
oraz rozróżnieniem pomiędzy stopniami złośliwości histopatologicznej. Poza
zidentyfikowaniem poszczególnych metabolitów, przeanalizowano szlaki metaboliczne w
których występują oraz określono ich związek z nowotworzeniem. Badanie wykazało też, że
wartość predykcyjna dla połączonych profili metabolitów jest wyższa w porównaniu z
pojedynczymi związkami.
W publikacjach pt. “Untargeted urinary metabolomics for bladder cancer biomarker
screening with ultrahigh-resolution mass spectrometry” oraz “Targeted and untargeted
urinary metabolic profiling of bladder cancer” przeanalizowano próbki moczu
pochodzące od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego oraz próbki moczu kontrolne. W
pierwszej publikacji zastosowano spektrometrię mas o ultra-wysokiej rozdzielczości w
dokładnej identyfikacji różnic w metabolomie moczu pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego (BC). Zidentyfikowano liczne metabolity, które mogą potencjalnie w sposób
bezinwazyjny różnicować próbki moczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego od próbek
moczu osób zdrowych. Poza wskazaniem poszczególnych metabolitów, przeanalizowano
szlaki metaboliczne w których występują. Nie udało się jednak zidentyfikować metabolitów,
różnicujących próbki moczu pomiędzy odmiennymi stopniami zaawansowania klinicznego i
stopniami złośliwości histopatologicznej. Odkrycia te mogą odegrać znaczącą rolę w
opracowaniu prostych, nieinwazyjnych i wysoce czułych testów diagnostycznych zdolnych
do wykrywania raka pęcherza moczowego.
W publikacji pt. “Targeted and untargeted urinary metabolic profiling of bladder cancer”
zastosowano zaawansowane techniki analityczne, takie jak NMR o wysokiej rozdzielczości i
LDI-MS do analizy profilu metabolomicznego moczu u pacjentów z rakiem pęcherza
moczowego. Podejście to doprowadziło do wykrycia 5 potencjalnych biomarkerów raka
pęcherza moczowego - 4-hydroksyfenylooctan, hipuran, mannitol, trygonelina i mocznik.
Metabolity te łącznie wykazywały doskonałą zdolność predykcyjną do rozróżniania między
moczem pochodzącym od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego i kontrolnych, z
wartościami AUC przekraczającymi 0,82. Dzięki zastosowaniu technik LDI-MS
51
zidentyfikowano szereg dodatkowych związków tj. związki aromatyczne, aminokwasy oraz
kwasy karboksylowe i ich pochodne. Poza ujawnieniem poszczególnych metabolitów,
przeanalizowano szlaki metaboliczne w których występują. Nie zidentyfikowano metabolitów
różnicujących moczy pochodzących od pacjentów z różnymi stopniami zaawansowania
klinicznego i stopniami złośliwości histopatologicznej. Zbierając powyższe w badaniu
wykazano, że identyfikacja zmian metabolicznych w moczu może utorować drogę do
opracowania nieinwazyjnej metody diagnostycznej do diagnozowania oraz monitorowania
leczenia pacjentów z rakiem pęcherza moczowego.
Podsumowując, wszystkie główne i poboczne cele badawcze zostały zrealizowane. Jednym
z ograniczeń badania jest stosunkowo mała grupa badawcza (12 pacjentów) z rakiem
pęcherza moczowego naciekającego mięśniówkę (MIBC), co może się przekładać na niską
istotność statystyczną wyników porównujących grupy pTa/pT1 (NMIBC) vs. MIBC (pT2). W
planowaniu kolejnych badań ten element musi być uwzględniony. Dodatkowo zdefiniowano
inne ograniczenia badania, które również należy uwzględnić w dalszych badaniach:
- Walidacja wyników. Biomarkery zidentyfikowane w tym badaniu wymagają walidacji
w większych, niezależnych kohortach, a ich użyteczność kliniczna musi zostać
oceniona w prospektywnych badaniach klinicznych, zanim zostaną one przyjęte do
praktyki klinicznej.
- Potrzeba badań prospektywnych. Chociaż niniejsze badanie dostarcza istotnych
informacji na temat potencjalnych biomarkerów raka pęcherza moczowego, wyniki te
są zasadniczo wstępne. Zidentyfikowane potencjalne biomarkery wymagają dalszej
walidacji w większych i bardziej zróżnicowanych populacjach pacjentów. Co więcej,
skuteczność kliniczna tych biomarkerów musi zostać oceniona w badaniach
prospektywnych, zanim zostaną one włączone do praktyki klinicznej. Konieczne jest
wykazanie ich wartości w stosunku do istniejących metod diagnostycznych i
prognostycznych poprzez badania porównujące różne metody.
- Potrzeba specjalistycznego sprzętu. Podczas gdy spektrometry mas stosowane są
przez liczne laboratoria w Polsce i na świecie do mikrobiologii i toksykologii
wdrożenie możliwości identyfikacji poszczególnych biomarkerów wymagałoby
opracowania ustandaryzowanych wzorców do ich identyfikacji i kwantyfikacji.
Spektroskopy jądrowego rezonansu magnetycznego to narzędzia bardzo drogie
służącae jak na razie tylko do celów badawczych i naukowych.
- Określenie dokładnych stężeń odkrytych biomarkerów. Podczas gdy MS jest bardziej
czuła i może wykryć szerszy zakres metabolitów, często ma trudności z
zapewnieniem bezwzględnej kwantyfikacji. Z drugiej strony, NMR, choć mniej czuły,
zapewnia bardziej wiarygodne dane ilościowe. Dlatego też określenie konkretnych
stężeń wykrytych biomarkerów może stanowić wyzwanie w zależności od
zastosowanej metody analitycznej.
- Ograniczona przydatność kliniczna biomarkerów tkankowych. Mimo, że analiza
metabolomiczna tkanek zapewnia cenny wgląd w biologię raka pęcherza
moczowego, jej przełożenie na zastosowanie kliniczne stanowi wyzwanie. Inwazyjny
charakter pobierania próbek tkanek, ich koszt i wymóg specjalistycznej infrastruktury
do przechowywania i przetwarzania sprawiają, że biomarkery moczu i surowicy są
bardziej pożądane do rutynowego stosowania klinicznego.
52
Streszczenie
Praca doktorska pt. “Metabolomiczna analiza tkanki, surowicy i moczu w poszukiwaniu
biomarkerów raka pęcherza moczowego” stanowi cykl 5 artykułów opublikowanych w
czasopismach posiadających wskaźnik impact factor. Jestem pierwszym autorem trzech
publikacji oraz współautorem pozostałych dwóch. Temat pracy doktorskiej porusza
zagadnienie metabolicznych biomarkerów nowotworowych raka pęcherza moczowego które
mogłyby być potencjalnie wykorzystywane w praktyce klinicznej.
Artykuły przedstawiają metabolomiczną analizę tkanki nowotworowej, surowicy i moczu
pochodzącej od 100 pacjentów z rakiem pęcherza moczowego w porównaniu z tkanką,
surowicą i moczem kontrolnym pochodzących od 100 pacjentów z innymi, łagodnymi,
schorzeniami w obrębie dróg moczowych. Zastosowane techniki analityczne obejmują
wysokiej rozdzielczości 1H NMR, ICP-OES i wysokiej rozdzielczości laserową
desorpcję/jonizację MS (LDI-MS) opartą na nanocząstkach złota i srebra oraz spektrometrię
mas o ultra-wysokiej rozdzielczości (UHRMS) w połączeniu z ultra-wysokosprawną
chromatografią cieczową (UHPLC). Wielowymiarowa analiza statystyczna i analiza krzywej
ROC pozwoliły na kompleksową ocenę potencjału diagnostycznego zidentyfikowanych
metabolitów. Połączenie poziomów tych metabolitów poprawiło rozróżnienie między
materiałem biologicznym pochodzącym od pacjentów z rakiem pęcherza moczowego w
porównaniu z kontrolą, sugerując, że uwzględnienie wielu biomarkerów może być kluczowe
dla precyzyjnej diagnozy. Dodatkowo analiza NMR próbek surowicy pozwoliła na
wyselekcjonowanie metabolitów, które odróżniają raka NMIBC i MIBC oraz metabolitów
różnicujących stopień złośliwości histopatologicznej (LG vs. HG). Wysokie wartości
obszarów pod krzywymi ROC wskazują na potencjalne zastosowanie kliniczne tych
metabolitów jako narzędzi diagnostycznych w przypadku raka pęcherza moczowego
Analizując dane z obrazowania MS, wyselekcjonowano 10 metabolitów różnicujących próbki
tkanki nowotworowej od zdrowej, które wykazały wysoką dokładność diagnostyczną w
analizie krzywej ROC, każdy z polem pod krzywą AUC >0.99. Analiza szlaków pozwoliła na
umiejscowienie tych metabolitów w 17 różnych szlakach metabolicznych.
Analiza surowicy z zastosowaniem metody 1H NMR pozwoliła na identyfikację 4 metabolitów
różnicujące surowice nowotworowe i kontrolne z doskonałą zdolnością predykcyjną
określoną na podstawie pola pod krzywą AUC wynoszącą 0.999. Analiza z zastosowaniem
ICP-OES zidentyfikowała dwa pierwiastki (Fe i Li) z polem pod krzywą AUC wynoszącą
0,807. Analiza z zastosowaniem spektrometrii mas LDI-MS oraz wysokorozdzielcza
spektrometria mas UHRMS umożliwiła dodatkową identyfikację odpowiednio 25 i 27
metabolitów różnicujących obydwie grupy. Ponadto w analizie LDI-MS i UHRMS
odpowiednio 5 i 23 metabolity wykazywały zdolność do rozróżnienia pomiędzy
poszczególnymi stopniami złośliwości histopatologicznej (grade) a surowicą kontrolną oraz 9
i 37 metabolity, które rozróżniały pomiędzy poszczególnymi stopniami zaawansowania
klinicznego (stage) a surowicą kontrolną. Wyselekcjonowano 5 metabolitów, które mogą
potencjalnie służyć jako biomarkery do rozróżniania raka pęcherza moczowego o niskim
stopniu złośliwości (LG) i raka pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości (HG), a
także 9 metabolitów, które mogą pomóc w rozróżnieniu stadiów zaawansowania choroby
53
pTa/pT1 (NMIBC) i pT2 (MIBC). Analiza szlaków i wzbogacona analiza szlaków pozwoliły na
umiejscowienie metabolitów w łącznie 24 różnych szlakach metabolicznych (17+7).
Próbki moczu poddano analizie 1H NMR, LDI-MS oraz UHRMS. Zidentyfikowano
odpowiednio 5, 25 i 51 metabolitów różnicujących mocz pochodzący od pacjentów z rakiem
pęcherza moczowego w porównaniu z kontrolnymi próbkami moczu. Wszystkie metabolity z
analizy 1H NMR, LDI-MS charakteryzowały się wysoką wartością predykcyjną określoną na
podstawie pola pod krzywą AUC > 0,87, zaś 5 z 51 metabolitów z analizy UHRMS
charakteryzowało się bardzo wysokim wskaźnikiem AUC > 0,9. Udało się również
zidentyfikować metabolity które rozróżniają pomiędzy poszczególnymi stopniami
zaawansowania klinicznego i stopniami złośliwości histopatologicznej w porównaniu z
kontrolnymi próbkami moczu. Nie zidentyfikowano jednak statystycznie istotnych różnic we
wzorcach metabolitów, które rozróżniałyby między sobą poszczególne stopnie
zaawansowania klinicznego (pTa vs. pT vs. pT2) lub stopnie złośliwości histopatologicznej
(LG vs HG). Analiza szlaków i wzbogacona analiza szlaków obydwu publikacji dotyczących
analizy metabolomicznej moczu pozwoliły na umiejscowienie metabolitów w łącznie 7
różnych szlakach metabolicznych (3+4).
Podsumowując wyniki tego badania dostarczają informacji na temat potencjalnych
biomarkerów metabolicznych raka pęcherza moczowego oraz powiązanych z nim zmian
metabolicznych zachodzących w raku pęcherza moczowego. Zidentyfikowane metabolity, na
podstawie wyników analizy statystycznej, wykazują potencjał jako biomarkery diagnostyczne
dla tego nowotworu. Analiza szlaków metabolicznych, w których występują te metabolity,
oraz ich związek z procesami nowotworowymi dodatkowo umożliwiają lepsze zrozumienie
patogenezy i biologii raka pęcherza moczowego. Dalsze badania i weryfikacja tych wyników
może przyczynić się do rozwoju nowych strategii diagnostycznych i terapeutycznych z
zakresu omawianej choroby.
54
Streszczenie po angielsku
The dissertation entitled: "Metabolomic analysis of tissue, serum and urine in the search for
biomarkers of bladder cancer" is a series of 5 articles published in impact factor journals. I
am the first author of three publications and co-author of the other two. The dissertation topic
addresses the issue of metabolic tumor biomarkers for bladder cancer that could potentially
be used in clinical practice.
The articles presents a metabolomic analysis of tumor tissue, serum and urine from 100
patients with bladder cancer compared to tissue, serum and control urine from 100 patients
with other, benign, urinary tract conditions. Analytical techniques used include
high-resolution 1H NMR, ICP-OES and high-resolution laser desorption/ionization MS
(LDI-MS) based on gold and silver nanoparticles, and ultra-high-resolution mass
spectrometry (UHRMS) combined with ultra-high performance liquid chromatography
(UHPLC). Multivariate statistical analysis and ROC curve analysis allowed a comprehensive
evaluation of the diagnostic potential of the identified metabolites. Combining the levels of
these metabolites improved the distinction between biological material from bladder cancer
patients compared to controls, suggesting that consideration of multiple biomarkers may be
crucial for accurate diagnosis. In addition, NMR analysis of serum samples allowed the
selection of metabolites that distinguish between NMIBC and MIBC cancers, as well as
metabolites that differentiate cancer grades (LG vs. HG). The high values of the areas under
the ROC curves indicate the potential clinical use of these metabolites as diagnostic tools for
bladder cancer
Analyzing MS imaging data, 10 metabolites were found to differentiate samples of cancerous
tissue from healthy tissue that showed high diagnostic accuracy in ROC curve analysis,
each with an area under the curve AUC > 0,99. Pathway analysis placed these metabolites
in 17 different metabolic pathways.
Serum analysis using 1H NMR identified 4 metabolites differentiating tumor and control sera
with excellent predictive ability as determined by the area under the AUC curve of 0.999.
Analysis using ICP-OES identified 2 elements: Fe and Li with an area under the AUC curve
of 0.807. Analysis using LDI-MS mass spectrometry and high-resolution UHRMS mass
spectrometry allowed the additional identification of 25 and 27 metabolites, respectively,
differentiating the two groups. In addition, in LDI-MS and UHRMS analysis, 5 and 23
metabolites, respectively, showed the ability to discriminate between different cancer grades
and control serum, and 9 and 37 metabolites that discriminated between different cancer
stage and control serum. 5 metabolites were selected that could potentially serve as
biomarkers to distinguish between low-grade bladder cancer (LG) and high-grade bladder
cancer (HG), as well as nine metabolites that could help distinguish between NMIBC
(pTa/pT1) and MIBC (pT2) . Pathway analysis and enriched pathway analysis located
metabolites in a total of 24 different metabolic pathways (17+7).
Urine samples were subjected to 1H NMR, LDI-MS and UHPLC-UHRMS analysis. A 5, 25
and 51 metabolites were identified, respectively, differentiating urine from bladder cancer
patients compared to controls. All metabolites from the 1H NMR, LDI-MS analysis had a high
predictive value as determined by area under the curve AUC > 0,87, while 5 of the 51
55
metabolites from the UHPLC-UHRMS analysis had a very high AUC of more than 0,9.
Moreover metabolites that discriminate between different clinical stages and grades in
comparison to control urine samples were identified. However, no statistically significant
differences in metabolite patterns were identified that distinguished between stages (pTa vs.
pT1 vs. pT2) or grades (LG vs. HG). Pathway analysis and enriched pathway analysis of
both publications on urine metabolomic analysis allowed us to locate metabolites in a total of
7 different metabolic pathways (3+4).
In summary, the results of this study provide information on potential metabolic biomarkers
for bladder cancer and related metabolic changes occurring in bladder cancer. The identified
metabolites, based on the results of statistical analysis, show potential as diagnostic
biomarkers for this cancer. Analysis of the metabolic pathways involved in these metabolites
and their association with tumorigenic processes further provides a better understanding of
the pathogenesis and biology of bladder cancer. Further research and verification of these
findings may contribute to the development of new diagnostic and therapeutic strategies for
this disease.
56
Piśmiennictwo
1. Cancer today. (n.d.). Cancer Today. http://gco.iarc.fr/today/home
2. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 - PubMed.
(2010, December 15). PubMed. https://doi.org/10.1002/ijc.25516
3. American Cancer Society | Cancer Facts & Statistics. (n.d.). American Cancer
Society | Cancer Facts & Statistics. http://cancerstatisticscenter.cancer.org/
4. Siegel, R. L., Miller, K. D., & Jemal, A. (2018, January). Cancer statistics, 2018. CA:
A Cancer Journal for Clinicians,68(1), 7–30. https://doi.org/10.3322/caac.21442
5. Kiemeney, L. A. L. M. (2008, January 1). Hereditary bladder cancer. Scandinavian
Journal of Urology and Nephrology,42(sup218), 110–115.
https://doi.org/10.1080/03008880802283755
6. Burger, M., Catto, J. W., Dalbagni, G., Grossman, H. B., Herr, H., Karakiewicz, P.,
Kassouf, W., Kiemeney, L. A., La Vecchia, C., Shariat, S., & Lotan, Y. (2013,
February). Epidemiology and Risk Factors of Urothelial Bladder Cancer. European
Urology,63(2), 234–241. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.07.033
7. Rink, M., Crivelli, J. J., Shariat, S. F., Chun, F. K., Messing, E. M., & Soloway, M. S.
(2015, August). Smoking and Bladder Cancer: A Systematic Review of Risk and
Outcomes. European Urology Focus,1(1), 17–27.
https://doi.org/10.1016/j.euf.2014.11.001
8. Dryson, E., ’t Mannetje, A., Walls, C., McLean, D., McKenzie, F., Maule, M., Cheng,
S., Cunningham, C., Kromhout, H., Boffetta, P., Blair, A., & Pearce, N. (2007,
November 20). Case-control study of high risk occupations for bladder cancer in New
Zealand. International Journal of Cancer,122(6), 1340–1346.
https://doi.org/10.1002/ijc.23194
9. Rollinson, D., Knopp, S., Levitz, S., Stothard, J. R., Tchuem Tchuenté, L. A., Garba,
A., Mohammed, K. A., Schur, N., Person, B., Colley, D. G., & Utzinger, J. (2013,
November). Time to set the agenda for schistosomiasis elimination. Acta Tropica,
128(2), 423–440. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2012.04.013
10. MacLennan, G. T., & Bostwick, D. G. (2019, April 15). Urologic Surgical Pathology (L.
Cheng, Ed.). Saunders.
11. Humphrey, P. A., Moch, H., Cubilla, A. L., Ulbright, T. M., & Reuter, V. E. (2016, July).
The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital
Organs—Part B: Prostate and Bladder Tumours. European Urology,70(1), 106–119.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2016.02.028
12. Lopez-Beltran, A. (2008, January 1). Bladder cancer: Clinical and pathological profile.
Scandinavian Journal of Urology and Nephrology,42(sup218), 95–109.
https://doi.org/10.1080/03008880802325226
13. Wein, A. J., Kavoussi, L. R., Partin, A. W., & Peters, C. A. (2015, November 5).
Campbell-Walsh Urology: 4-Volume Set. Elsevier.
14. Shokeir, A. (2004, January). Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology,
diagnosis and treatment. BJU International,93(2), 216–220.
https://doi.org/10.1111/j.1464-410x.2004.04588.x
15. EL-Mekresh, EL-Baz, Abol-Enein, & Ghoneim. (1998, August). Primary
adenocarcinoma of the urinary bladder: BJU International,82(2), 206–212.
https://doi.org/10.1046/j.1464-410x.1998.00718.x
57
16. Abol-Enein, H., Kava, B. R., & Carmack, A. J. (2007, January). Nonurothelial Cancer
of the Bladder. Urology,69(1), 93–104. https://doi.org/10.1016/j.urology.2006.08.1107
17. Wright, J. L., Porter, M. P., Li, C. I., Lange, P. H., & Lin, D. W. (2006). Differences in
survival among patients with urachal and nonurachal adenocarcinomas of the
bladder. Cancer,107(4), 721–728. https://doi.org/10.1002/cncr.22059
18. Humphrey, P. A., Moch, H., Cubilla, A. L., Ulbright, T. M., & Reuter, V. E. (2016, July).
The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital
Organs—Part B: Prostate and Bladder Tumours. European Urology,70(1), 106–119.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2016.02.028
19. Mishriki, S. F., Nabi, G., & Cohen, N. P. (2008, January). Diagnosis of Urologic
Malignancies in Patients with Asymptomatic Dipstick Hematuria: Prospective Study
with 13 Years’ Follow-up. Urology,71(1), 13–16.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2007.08.031
20. Grossfeld, G. D., Litwin, M. S., Wolf, J., Hricak, H., Shuler, C. L., Agerter, D. C., &
Carroll, P. R. (2001, April). Evaluation of asymptomatic microscopic hematuria in
adults: the American Urological Association best practice policy—part I: definition,
detection, prevalence, and etiology. Urology,57(4), 599–603.
https://doi.org/10.1016/s0090-4295(01)00919-0
21. Kamat, A. M., Hegarty, P. K., Gee, J. R., Clark, P. E., Svatek, R. S., Hegarty, N.,
Shariat, S. F., Xylinas, E., Schmitz-Dräger, B. J., Lotan, Y., Jenkins, L. C., Droller, M.,
van Rhijn, B. W., & Karakiewicz, P. I. (2013, January). ICUD-EAU International
Consultation on Bladder Cancer 2012: Screening, Diagnosis, and Molecular Markers.
European Urology,63(1), 4–15. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.09.057
22. Jocham, D., Stepp, H., & Waidelich, R. (2008, June). Photodynamic Diagnosis in
Urology: State-of-the-Art. European Urology,53(6), 1138–1150.
https://doi.org/10.1016/j.eururo.2007.11.048
23. Kamat, A. M., Hegarty, P. K., Gee, J. R., Clark, P. E., Svatek, R. S., Hegarty, N.,
Shariat, S. F., Xylinas, E., Schmitz-Dräger, B. J., Lotan, Y., Jenkins, L. C., Droller, M.,
van Rhijn, B. W., & Karakiewicz, P. I. (2013, January). ICUD-EAU International
Consultation on Bladder Cancer 2012: Screening, Diagnosis, and Molecular Markers.
European Urology,63(1), 4–15. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2012.09.057
24. Svatek, R. S., Sagalowsky, A. I., & Lotan, Y. (2006, July). Economic impact of
screening for bladder cancer using bladder tumor markers: A decision analysis.
Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations,24(4), 338–343.
https://doi.org/10.1016/j.urolonc.2005.11.025
25. Lokeshwar, V. B., Habuchi, T., Grossman, H. B., Murphy, W. M., Hautmann, S. H.,
Hemstreet, G. P., Bono, A. V., Getzenberg, R. H., Goebell, P., Schmitz-Dräger, B. J.,
Schalken, J. A., Fradet, Y., Marberger, M., Messing, E., & Droller, M. J. (2005,
December). Bladder tumor markers beyond cytology: International Consensus Panel
on bladder tumor markers. Urology,66(6), 35–63.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2005.08.064
26. Sievert, K. D., Amend, B., Nagele, U., Schilling, D., Bedke, J., Horstmann, M.,
Hennenlotter, J., Kruck, S., & Stenzl, A. (2009, March 7). Economic aspects of
bladder cancer: what are the benefits and costs? World Journal of Urology,27(3),
295–300. https://doi.org/10.1007/s00345-009-0395-z
27. Lokeshwar, V. B., Habuchi, T., Grossman, H. B., Murphy, W. M., Hautmann, S. H.,
Hemstreet, G. P., Bono, A. V., Getzenberg, R. H., Goebell, P., Schmitz-Dräger, B. J.,
Schalken, J. A., Fradet, Y., Marberger, M., Messing, E., & Droller, M. J. (2005,
58
December). Bladder tumor markers beyond cytology: International Consensus Panel
on bladder tumor markers. Urology,66(6), 35–63.
https://doi.org/10.1016/j.urology.2005.08.064
28. Kotarba. (n.d.). Spektrometria mas w badaniu materiałów - wykład.
29. Veenstra, T. D. (2012). Metabolomics: the final frontier? Genome Medicine,4(4), 40.
https://doi.org/10.1186/gm339
30. Griffin, J. L., & Shockcor, J. P. (2004, July 1). Metabolic profiles of cancer cells.
Nature Reviews Cancer,4(7), 551–561. https://doi.org/10.1038/nrc1390
31. Meding, S., Nitsche, U., Balluff, B., Elsner, M., Rauser, S., Schöne, C., Nipp, M.,
Maak, M., Feith, M., Ebert, M. P., Friess, H., Langer, R., Höfler, H., Zitzelsberger, H.,
Rosenberg, R., & Walch, A. (2012, February 3). Tumor Classification of Six Common
Cancer Types Based on Proteomic Profiling by MALDI Imaging. Journal of Proteome
Research,11(3), 1996–2003. https://doi.org/10.1021/pr200784p
32. Beginner’s Guide to Mass Spectrometry | Waters. (n.d.). Beginner’s Guide to Mass
Spectrometry | Waters.
https://www.waters.com/nextgen/en/education/primers/the-mass-spectrometry-primer
.html
33. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., & Li, L. (2017, December 13). Mass
Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.
Analytical Chemistry,90(1), 240–265. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04733
34. Müller, W. H., Verdin, A., De Pauw, E., Malherbe, C., & Eppe, G. (2020, November
10). Surface‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging: A
review. Mass Spectrometry Reviews,41(3), 373–420.
https://doi.org/10.1002/mas.21670
35. NMR Spectroscopy Principles, Interpreting an NMR Spectrum and Common
Problems. (n.d.). Analysis & Separations From Technology Networks.
http://www.technologynetworks.com/analysis/articles/nmr-spectroscopy-principles-int
erpreting-an-nmr-spectrum-and-common-problems-355891
36. Emwas, A. H. M. (2015). The Strengths and Weaknesses of NMR Spectroscopy and
Mass Spectrometry with Particular Focus on Metabolomics Research. Methods in
Molecular Biology, 161–193. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2377-9_13
37. Amberg, A., Riefke, B., Schlotterbeck, G., Ross, A., Senn, H., Dieterle, F., & Keck, M.
(2017). NMR and MS Methods for Metabolomics. Methods in Molecular Biology,
229–258. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7172-5_13
38. Chen, Y., Li, E. M., & Xu, L. Y. (2022, April 15). Guide to Metabolomics Analysis: A
Bioinformatics Workflow. Metabolites,12(4), 357.
https://doi.org/10.3390/metabo12040357
39. Anwardeen, N. R., Diboun, I., Mokrab, Y., Althani, A. A., & Elrayess, M. A. (2023,
June 15). Statistical methods and resources for biomarker discovery using
metabolomics. BMC Bioinformatics,24(1).
https://doi.org/10.1186/s12859-023-05383-0
40. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., & Raftery, D. (2014). Statistical Analysis and Modeling
of Mass Spectrometry-Based Metabolomics Data. Methods in Molecular Biology,
333–353. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1258-2_22
41. De Livera, A. M., Olshansky, M., & Speed, T. P. (2013). Statistical Analysis of
Metabolomics Data. Methods in Molecular Biology, 291–307.
https://doi.org/10.1007/978-1-62703-577-4_20
42. MetaboAnalyst. (n.d.). MetaboAnalyst. https://www.metaboanalyst.ca/
59
43. Galal, A., Talal, M., & Moustafa, A. (2022, November 24). Applications of machine
learning in metabolomics: Disease modeling and classification. Frontiers in Genetics,
13. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.1017340
44. Palmer, E. (2019, November 22). Quick Guide to Random Forests. Medium.
https://towardsdatascience.com/quick-guide-to-random-forests-5d2a6b233d1f
45. ICP-OES – ICP Chemistry, ICP-OES Analysis, Strengths and Limitations. (n.d.).
Analysis & Separations From Technology Networks.
http://www.technologynetworks.com/analysis/articles/icp-oes-icp-chemistry-icp-oes-a
nalysis-strengths-and-limitations-342265
60
Załączniki
7.1 Zgoda komisji Bioetycznej Uniwersytetu Rzeszowskiego na przeprowadzenie badania.
61
7.2 Udział poszczególnych autorów i współautorów w powstanie publikacji.
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
Monoisotopic silver nanoparticles-based mass spectrometry imaging of
human bladder cancer tissue: Biomarker discovery
Krzysztof Ossoli
nski
a
, Tomasz Ruman
b
, Tadeusz Ossoli
nski
a
, Anna Ossoli
nska
a
,
Adrian Arendowski
b
, Artur Kołodziej
b
,
c
, Aneta Płaza-Altamer
b
,
c
, Joanna Nizioł
b
,
*
a
Department of Urology, John Paul II Hospital, Kolbuszowa, Poland
b
Rzesz
ow University of Technology, Faculty of Chemistry, Rzesz
ow, Poland
c
Doctoral School of Engineering and Technical Sciences at the Rzesz
ow University of Technology, Rzesz
ow, Poland
ARTICLE INFO
Keywords:
Silver nanoparticles
LDI-MS
Biomarkers
Bladder cancer
Human tumor tissue
ABSTRACT
Purpose: Bladder cancer (BC) is the 10th most common form of cancer worldwide and the 2nd most common
cancer of the urinary tract after prostate cancer, taking into account both incidence and prevalence.
Materials/methods: Tissues from patients with BC and also tissue extracts were analyzed by laser desorption/
ionization mass spectrometry imaging (LDI-MSI) with monoisotopic silver-109 nanoparticles-enhanced target
(
109
AgNPET).
Results: Univariate and multivariate statistical analyses revealed 10 metabolites that differentiated between tumor
and normal tissues from six patients with diagnosed BC. Selected metabolites are discussed in detail in relation to
their mass spectrometry (MS) imaging results. The pathway analysis enabled us to link these compounds with 17
metabolic pathways.
Conclusions: According to receiver operating characteristic (ROC) analysis of biomarkers, 10 known metabolites
were identified as the new potential biomarkers with areas under the curve (AUC) higher than >0.99. In both
univariate and multivariate analysis, it was predicted that these compounds could serve as useful discriminators of
cancerous versus normal tissue in patients diagnosed with BC.
1. Introduction
Bladder cancer (BC) is the 12th most common form of cancer
worldwide and the 2nd most common cancer of the urinary tract after
prostate cancer, taking into account both incidence and prevalence [1].
Globally, 573,278 new cases of BC were diagnosed in 2020. In terms of
incidence, it is the 6th most common cancer in men, the 17th in women
and the 10th most frequent cancer in both sexes [1]. Cystoscopic exam-
ination of bladder remains the gold standard for BC diagnosis, but it is
invasive, associated with discomfort, sometimes painful and costly. It is
estimated that 4–27% of tumors are omitted during the examination.
This value increases to 32–77% in the case of carcinoma in situ (CIS) [2].
In recent years, numerous urine-based BC biomarkers have been
evaluated but currently there is no reliable diagnostic and prognostic BC
biomarker that has been accepted for diagnosis and follow-up in routine
practice or clinical guidelines and which could be an alternative to
cystoscopy. Over the past decade, due to the molecular specificity and
sensitivity mass spectrometry (MS) has been used as a main technique in
biomarker discovery field [3]. Two-dimensional variety of MS –mass
spectrometry imaging (MSI) plays an increasingly important role in the
field of molecular imaging because it allows direct mapping of the distri-
bution of a variety of endogenous and exogenous compounds within bio-
logical tissues with high specificity and without the need for radioactive or
fluorescent radioactive labelling normally used in histochemical protocols
[4]. BC tissues were studied previously with MSI techniques such as
matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) [5] and desorption
electrospray ionization (DESI) [6]. It should be noted that there are no BC
MS and MSI results made with the use of nanoparticle-based methods
published to date. It is important to state that nanoparticle-based methods
have many advantages with regard to other methods including very effi-
cient cationization of low molecular weight compounds, relatively high
sensitivity of analyte detection, very low chemical background and high
mass accuracy due to internal calibration, unlike commonly used one -
MALDI. They allow for higher lateral resolutions and higher sensitivity
when compared to DESI. In our recent publications we presented new
methods such as gold nanoparticle-enhanced target (AuNPET) [7], silver
* Corresponding author. University of Technology, Faculty of Chemistry, 6 Powsta
nc
ow Warszawy Ave., 35-959, Rzesz
ow, Poland.
E-mail address: jniziol@prz.edu.pl (J. Nizioł).
Contents lists available at ScienceDirect
Advances in Medical Sciences
journal homepage: www.elsevier.com/locate/advms
https://doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002
Received 21 May 2022; Received in revised form 5 September 2022; Accepted 8 December 2022
1896-1126/©2022 Medical University of Bialystok. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
nanoparticle-enhanced target (AgNPET) [8] and monoisotopic silver-109
nanoparticles-enhanced target (
109
AgNPET) [9] with results of their
application for imaging of plant, animal and human tissues [10–12].
2. Materials and methods
2.1. Participants
Cancer and normal tissue samples were collected from 6 patients
(Caucasian race, average age 65 years, 2 females and 4 males) with
diagnosed BC at John Paul II Hospital in Kolbuszowa (Poland). All pa-
tients underwent transurethral resection of bladder tumor (TURBT)
following a detailed clinical history and laboratory examination. Each of
these patients had at least an abdominal ultrasound to exclude other
tumors (patients with urolithiasis usually also had a CT scan) and a basic
package of laboratory tests required for urological surgery to exclude
inflammation. Whole tumor and a small fragment of adjacent healthy
uroephitelium were resected (cancer and control tissue). The histopath-
ological analysis of resected tumors from all patients, confirmed non-
invasive (pTa) low-grade (LG) urothelial papillary carcinoma, accord-
ing to 2004 WHO grading system [13,14]. Control tissues were free of
cancer cells. The clinical characteristics of the patients are presented in
Supplementary Table S1.
2.2. Materials and equipment
Silver-109 (min. 99.75% of
109
Ag) isotope was purchased from
BuyIsotope (Neonest AB, Stockholm, Sweden) and transformed to tri-
fluoroacetate salt by commonly known methods (involving dissolving in
HNO
3
, precipitation of
109
AgOH and reaction with trifluoroacetic acid)
and recrystallized from tetrahydrofurane/hexane system. 2,5-Dihydroxy-
benzoic acid (DHB) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
Steel targets were locally machined from H17 stainless steel. All solvents
were of high-performance liquid chromatography (HPLC) quality, except
for water (18 MΩwater was produced locally) and methanol (liquid
chromatography-mass spectrometry - LC MS - grade, Fluka™, (Seelze,
Germany). The silver-109 nanoparticles were synthesized on the surface
of steel targets as described in our recent publication [9]. Optical pho-
tographs of tissue samples were made with the use of an Olympus SZ10
microscope equipped with an 8 MPix Olympus digital camera (Hamburg,
Germany).
2.3. Preparation of monoisotopic silver suspension
Four miligrams of silver-109 trifluoroacetate (
109
AgTFA) and 14 mg
of DHB were quantitatively transferred to a glass tube by dissolving in 2
ml of isopropanol and 2 ml of acetonitrile. The prepared solution was
placed in an ultrasonic bath set at 50 C for about 30 min. After this time,
the suspension was ready to use.
2.4. Imaging sample preparation
Tissues from 6 patients with the same tumor stage and grade were
selected for LDI-MSI analysis. Three independent imaging experiments
were performed to exclude possible random results, one for tissues from
patient no. 1, another for patients no. 2–4 and the last for patients no. 5
and 6. The material examined was six pairs of BC and normal tissue
fragments of average 3 3 mm size. MS imaging for patient no. 1 was
carried out within about an hour after the material was collected after
surgery. Until then, the tissue samples were stored at a temperature of
approx. 2–4C. Tissues from patients no. 2–6 were stored at 60 C and
thawed to 4 C before the MSI measurements. To remove excess liquid
material, samples were touched to cellulose filter paper (3 times). Next,
with the use of sterile needles and tweezers, a few imprints of the
examined tissues were made on the previously prepared
109
AgNPET
plate. The material was transferred from the BC patients to the
109
AgNPET substrate by briefly touching (3 s) the tissue samples to steel
surface with light pressure. Steel target with imprints was placed on a
computer-controlled 3D positioning table and sprayed with nanoparticles
using an electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) nebulizer
with nitrogen as nebulizing gas (2 bar). Target was placed in a MALDI
time-of-flight MS (MALDI-ToF/ToF MS) (Autoflex Speed ToF/ToF,
Bruker, Bremen, Germany) and selected imprints were then directly
analyzed.
2.5. LDI-MS imaging experiments
LDI-MSI experiments were performed using a Bruker Autoflex Speed
ToF/ToF mass spectrometer (MALDI ToF/ToF, Bruker, Bremen, Ger-
many) in positive-ion reflectron mode. FlexImaging 4.0 software was
used for data processing and analysis. The apparatus was equipped with a
SmartBeam II 1000 Hz 355 nm laser. Laser impulse energy was approx-
imately 100–190
μ
J, laser repetition rate was 1000 Hz, and deflection
was set on m/z lower than 80 Da. The m/z range was 802000 Da, spatial
resolution 250 250
μ
m. The experiments were made with 20,000 laser
shots per individual spot with a default random walk applied (random
points with 50 laser shots). All spectra were calibrated with the use of
silver ions (
109
Ag
þ
to
109
Ag
10
þ
). The first accelerating voltage was held at
19 kV, and the second ion source voltage was held at 16.7 kV. Reflector
voltages used were 21 kV (the first) and 9.55 kV (the second). All of the
ion images were within 0.05% of m/z. Total ion current (TIC)
normalization was used for all results shown.
2.6. Preparation of tissue extracts
Small portions of frozen neoplastic bladder tissue (n ¼6) and normal
control tissues (n ¼6) of approximately 2 mg each were transferred to
Eppendorf tubes and then homogenized by three cycles of freezing and
thawing. Next to the homogenates 500
μ
l of 2:1 (v/v) chloroform/
methanol were added and then extracted for 30 min in ultrasonic bath (at
2–4C.) The tubes were centrifuged for 5 min at an acceleration of
6000gand the phases were allowed to separate. The water-methanol
and methanol-chloroform phases were transferred to separate tubes
and then methanol-chloroform phases were diluted 100x whereas the
water-methanol phases were measured without dilution. Volume of 0.3
μ
l of each sample was placed on
109
AgNPET and allowed to dry at room
temperature and target placed in a MALDI ToF/ToF MS. Tissue extracts
were made to confirm the structure of the identified compounds by MS/
MS measurements.
2.7. LDI-MS and MS/MS of tissue extracts
LDI-MSI experiments were performed using a Bruker Autoflex Speed
MALDI ToF/ToF MS (Autoflex Speed ToF/ToF, Bruker, Bremen, Ger-
many) in positive-ion reflectron mode. The apparatus was equipped with
a SmartBeam II 1000 Hz 355 nm laser. Laser impulse energy was
approximately 100–190
μ
J, laser repetition rate was 1000 Hz, and
deflection was set on m/z lower than 80 Da. The m/z range was 802000
Da. Spectrum for each extract contained data from 20k laser shots with a
default random walk applied (random points with 50 laser shots). All
spectra were calibrated with the use of silver ions (
109
Ag
þ
to
109
Ag
10
þ
).
The first accelerating voltage was held at 19 kV, and the second ion
source voltage was held at 16.7 kV. Reflector voltages used were 21 kV
(the first) and 9.55 kV (the second). MS/MS measurements were per-
formed using the LIFT (low mass) method [15]. The mass window for
precursor ion selection used was 0 Da. FlexAnalysis (version 4.0,
Bruker, Bremen, Germany) was used for data analysis.
2.8. Data processing
The average spectra of the imprint area of cancerous and normal
tissue from patient no. 1 were generated and then compared in the using
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
39
the SCiLS Lab software version 2016b (SCiLS, Bremen, Germany) and
FlexAnalysis (version 4.0, Bruker, Bremen, Germany). Statistical analysis
was performed using the Cardinal MSI (R package) [16] with hotspot
suppression and Gaussian smoothing applied and MetaboAnalyst 5.0
platform [17]. Database search of chemical compounds were carried out
using a custom-made program. Theoretical m/z values were calculated
using ChemCalc program available online [18].
Data of peak mean abundance from the entire area of the examined
cancer (n ¼6) and control (n ¼6) tissue were formatted as comma
separated values (.csv) files and uploaded to the MetaboAnalyst 5.0
server [17]. Metabolite data was checked for data integrity and
normalized using MetaboAnalyst's normalization protocols (normaliza-
tion by sum, log transformation and auto-scaling), both for biomarker
and pathway analyses. Univariate analysis (t-test), fold-change analysis
and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA)
were applied to calculate the statistical significance of the metabolites
between the two groups (cancer over control). To identify the potential
biomarkers associated with BC, the Receiver Operating Characteristic
(ROC) curve was applied using biomarker analysis module of Metab-
oAnalyst v 5.0. The ROC curves were generated using an algorithm based
on Monte-Carlo cross validation (MCCV) through balanced subsampling
coupled with linear support vector machine (SVM) for the classification
method and SVM built-in for the feature ranking method. To identify the
most relevant metabolic pathways involved in BC, metabolic pathway
analysis was performed using MetaboAnalyst with Homo sapiens pathway
libraries.
3. Ethical issues
The study protocol was approved by local Bioethics Committee at the
University of Rzeszow, Poland (permission no. 2018/04/10) and per-
formed in accordance with relevant guidelines and regulations, including
the 1964 Helsinki declaration and its later amendments. Specimens and
clinical data from patients involved in the study were collected with
written consent.
4. Results and discussion
109
AgNPET method was used previously for LDI-MS analysis of low
molecular weight (LMW) compounds and biological material and was
shown to be a promising alternative to traditional MALDI method [9,19].
LDI-MSI experiments were performed by measuring series of
high-resolution MS spectra with 250 250
μ
m resolution of bladder
tissue imprints of ca. 33 mm size made on
109
AgNPET target plate. In
order to estimate whether there is a sample-related differentiation be-
tween cancer and normal tissue imprints, a statistical analysis was per-
formed for patient no. 1 tissue pair. Data derived from MSI experiment
were analyzed by comparison of average spectra of cancer and normal
areas by spatial shrunken centroids with adaptive weights (SSCA). The
mentioned method allows estimation of the probability that a location of
interest belongs to a particular segment and was previously used among
others for segmentation of data for whole-body MALDI MSI experiment
[20]. Images of the major regions of the BC tissue from patient no. 1 were
outlined by SSCA segmentation as shown in Supplementary Fig. S1. What
is interesting, images generated with the aid of Cardinal MSI with SSCA
method are very similar to the ion images obtained in MSI experiment
and suggest that: (i) areas of imprints are clearly different from target
area with no fuzzy boundaries and (ii) cancerous area is clearly different
from the normal one.
4.1. Identification of metabolite biomarkers
The analysis of MSI data revealed a list of 28 compounds for which
the highest abundance differences between the normal and cancerous
areas. Only those ion images were selected for which the trend for a given
m/z value was similar in all 6 experiments. As judged from generated ion
images 2 adducts have higher average intensities in cancer tissue, and the
next 26 ions are of higher intensity in normal tissue. The list of identified
compounds is presented in Supplementary Table S2. The identity of some
of compounds was confirmed with LIFT®MS/MS experiments (Supple-
mentary Table S3). Metabolite mean abundance data from both cancer
and normal tissue regions of 28 identified compounds were further
subjected to supervised and unsupervised multivariate statistical analysis
using the MetaboAnalyst 5.0 online software. The 2D principal compo-
nents analysis (PCA) score plots of both subsets indicated good separa-
tion between the cancer and the normal tissue regions (Fig. 1A).
The best separation of groups was obtained along principal compo-
nents 1 and 2 (i.e. PC1 and PC2) which accounted for 61.2% and 18.8%,
respectively. The separation between the BC and normal tissue samples
was further examined using the supervised multivariate statistical anal-
ysis - Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA)
(Fig. 1B). We conducted 2000 permutation tests to evaluate the statistical
robustness of the OPLS-DA model (Supplementary Fig. S2). Good
discrimination was observed between cancer and normal groups (Q
2
¼
0.774, R
2
Y¼0.998, P-value <0.03 (0/2000)). Potential BC biomarkers
were selected on the basis of the variable influence on projection (VIP)
value resulting from the OPLS-DA model (Fig. 1C). By combining the VIP
(>1.0) with the results from the independent t-test (P-value from t-test
<0.05) and fold change analysis (0.5 <FC >1.2) 10 metabolites were
selected as differential for BC tissue and normal samples (Table 1). All
data for identified compounds analyzed within this work are presented in
Supplementary Table S2.
Next, univariate ROC curve analysis was separately performed to
evaluate the diagnostic ability of the models. ROC curves analyses were
used to estimate the accuracy of combined signatures model of imaging
data. The areas under curves (AUC) of ROC curves were used to deter-
mine the diagnostic effectiveness of important metabolites. Applying a
ROC approach to biomarker analysis allowed characterization of diag-
nostic accuracy, and evaluation of the predictive accuracy. The results
indicated that all previously selected metabolites have AUC above 0.81
(Table 1). The best ROC analyses with the highest statistical significance
were obtained for hypotaurine and 3-methylbutanal (AUC ¼0.944,
specificity ¼1.0 and sensitivity ¼0.8). The classification ROC model was
based on a random forest algorithm. As shown in Fig. 1D, the combina-
tion of levels of 10 selected metabolites was a better discriminator (AUC
¼0.993) than each metabolite separately. The results suggest that 10
specific metabolites: glycine, hypotaurine, 3-methylbutanal, ethyl-
phosphate, glutamine, myosmine, PI(22:0/0:0), aminopentanal, proline
betaine and methylguanidine coul, significantly increase the diagnostic
potential and serve as useful discriminators of cancer tissues from normal
tissues in patients diagnosed with BC. Ion images of all these compounds
that differentiate the neoplastic and normal area to the greatest extent
are presented in Figs. 2 and 3.
Ion images of 2 amino acids that play essential roles in human tissues
were generated and the structure of one of them was confirmed with LIFT
MS/MS method. One of the ion images of m/z 98.021 (Fig. 2 A) shows
spatial distribution of the [C
2
H
5
NO
2
þNa]
þ
adduct (sodiated glycine).
This ion was found to be present at a higher intensity in the normal tissue
compared with the cancer tissue. The decreased levels of glycine were
observed in lung cancer patients [21] and in serum of BC patients [22].
Similarly, ion assigned to potassium adduct of glutamine (m/z 185.032,
Fig. 2 E) was found at a higher intensity in the normal tissue compared to
the cancer tissue. NMR-based metabolomics studies have shown the
decreased blood levels of glutamine in plasma samples from pancreatic
cancer patients [23]. The decrease in the levels of the amino acids dis-
cussed above indicates an increased demand for these metabolites for
tumor growth. This observation suggests that tumor's biochemistry may
be associated with an increased glycolytic flux that has been found to be a
major source of respiratory energy for tumor cells, and with the need for
increased protein synthesis in tumor cells [24]. It has also been suggested
that glycolysis is required to maintain lipogenesis and cholesterogenesis,
that are essential for the growth and proliferation of tumor cells [25].
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
40
Moreover, it was found that glycine metabolism is necessary and suffi-
cient for cell transformation and malignancy [26].
In the present study, 11 lipids that play essential roles in the human
body showed a large differentiation between neoplastic and normal tissue,
and their structures were in some cases successfully confirmed with LIFT
MS/MS method (Supplementary Tables S2 and S3). We found, that 5 ions
of
109
Ag isotope adducts of phosphoglycerol PG(32:1) (m/z 829.398),
phosphoinositol PI(22:0/0:0) (m/z 765.294), phosphoserines PS(O-30:1)
(m/z 800.383), PS(30:1) (m/z 814.362), phosphoethanolamine PE(34:4)
(m/z 820.388), 4 sodium adducts of diacylglyceride DG(44:1) (m/z
757.668), phosphocholine PC(40:10) (m/z 848.520), phosphoglycer-
olphosphate PGP(32:1) (m/z 801.471), phosphoethanolamine PE(26:1)
(m/z 628.395), and 2 potassium adducts of phosphoserine PS(36:4) (m/z
822.468), sphingomyeline SM(d18:0/12:0) (m/z 689.499), dominated in
the cancer tissue MSI region compared to normal tissue. However, only 1
lipid - PI(22:0/0:0) showed statistically significant differentiation between
normal and neoplastic tissues (Fig. 3A). Lipids are the building blocks of
cell membranes and play important roles in various biological processes,
such as cellular signaling, chemical-energy storage, homeostasis,
apoptosis, metabolism, cell adhesion and migration, neurotransmission,
signal transduction, vesicular trafficking, post-translational modifications
and cell–cell interactions in tissues. These cellular processes are associated
with cellular transformations, cancer progression and metastasis. Lipids
are linked to cancer at the metabolic level and are expected to be present in
Fig. 1. Metabolomic analysis of tissue samples from bladder cancer (BC) patients. (A) PCA and (B) OPLS-DA scores plots of the cancer (red) and control (green) tissue
samples. (C) VIP plot from OPLS-DA analysis. (D) The receiving operator characteristic (ROC) curves for the 10 selected metabolites.
Table 1
Mean metabolite abundance for controls vs. bladder cancer tissues. Bolded metabolites are considered statistically significantly different (P-value <0.05; VIP >1; FC <
0.5 and >1.2) between controls and cancer tissues.
No. Compound name Addut type m/z
c
P-value
d
Fold Change
e
VIP
f
AUC Power of the test
Sensitivity [%] Specificity [%]
1 Glycine
a
[C
2
H
5
NO
2
þNa]þ98.021 0.0025 0.30 1.56 0.92 100 83
2 Hypotaurine
a
[C
2
H
7
NO
2
Sþ
109
Ag]
þ
217.924 0.0035 1.39 1.54 0.94 83 100
3 3-Methylbutanal
a
[C
5
H
10
OþH]
þ
87.080 0.0053 0.19 1.47 0.94 83 100
4 Ethylphosphate
a
[C
2
H
7
O
4
PþK]
þ
164.971 0.0088 0.30 1.41 0.92 83 83
5 Glutamine
b
[C
5
H
10
N
2
O
3
þK]
þ
185.032 0.0147 0.29 1.35 0.92 83 83
6 Myosmine
b
[C
9
H
10
N
2
þH]
þ
147.092 0.0147 0.29 1.35 0.92 83 83
7 PI(22:0/0:0)
a
[C
31
H
61
O
12
Pþ
109
Ag]
þ
765.294 0.0171 0.19 1.32 0.92 100 83
8 Aminopentanal
b
[C
5
H
11
NO þH]
þ
102.091 0.0214 0.39 1.29 0.83 100 67
9 Proline betaine
a
[C
7
H
13
NO
2
þNa]
þ
166.084 0.0417 0.44 1.17 0.83 100 67
10 Methylguanidine
a
[C
2
H
7
N
3
þNa]
þ
96.053 0.0451 0.45 1.16 0.81 67 83
Abbreviations: AUC - area under the curve; FC - fold change; PI - phosphatydylinositol; PS –phosphatidylserine; VIP - variable influence on projection.
a
Putative identification.
b
Identity confirmed with LIFT MS/MS method.
c
Calculated m/z values.
d
P-value determined from Student's t-test.
e
Fold change between cancer and control tissue samples.
f
VIP scores derived from OPLS-DA model.
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
41
cancer cells, tissues and biofluids. Multiple studies have demonstrated
altered lipid profiles in biological samples that have been screened to
identify biomarkers in cancer research [27,28]. Several reports have
shown the spatial distributions of many potential lipid-based biomarkers in
various malignant tumors such as lung [29], breast [30], ovarian [31],
colorectal [32], prostate [33], kidney [34], renal [35], bladder [36]and
thyroid cancers [37]. Dill et al. [38] demonstrated distributions of the
multiple lipids and free fatty acids species between cancerous and
noncancerous dog bladder tissue samples with desorption electrospray
ionization MS (DESI-MS). The same group of researchers in another study
used human BC tissue samples to visualize of glycerophospholipid (GP)
distribution in cancerous and normal tissue. They found that tumor tissue
shows increased intensities for different GPs such as phosphatidylserine
(PS) and phosphatidylinositol (PI) when compared to the normal tissue
[36]. Wittman et al. [39], measured multiple distinct compounds in human
urine samples, that differentiate BC from non-cancer controls. They
selected 25 potential biomarkers related to lipid metabolism.
Ion assigned to proton adduct of 3-methylbutanal (m/z 87.080;
Fig. 2C) was found in higher intensity in normal tissue compared to
cancer tissue. 3-Methylbutanal also known as isovaleraldehyde is an
aldehyde that occurs naturally in all eukaryotes. In humans, this com-
pound has been found to be associated with several diseases. Previous
research revealed significantly reduced level of 3-methylbutanal in urine
samples from patients with clear cell renal cell carcinoma which may be
associated with higher level of aldehyde dehydrogenase that converts
aldehydes to their respective carboxylic acids and is often upregulated in
cancer [40]. Furthermore, in the human lung cancer cell line, 3-methyl-
butanal was found at decreased concentrations [41].
One of the ion images of m/z 166.084 (Fig. 2C) shows spatial distri-
bution of the sodium adduct of proline betaine. This secondary metab-
olite has been described previously as a highly effective osmoprotectant
in many plants. In humans, proline betaine was at reduced levels in
plasma samples from patients with esophageal squamous cell carcinoma
compared to healthy controls which is also in line with our results [42].
Similar results were obtained in metabolomic analysis of serum samples
from patients with preeclampsia [43]. Proline betaine was found to be
up-regulated in urine samples from patients with uterine cervix cancer
and renal cell carcinoma [44,45].
The MSI results of the bladder tissue imprint suggest, that the ion of
m/z 96.053 (Fig. 3 D) corresponds to sodiated adduct of methylguanidine
which was found in higher abundance in normal tissue. Methylguanidine
is an organic compound containing a guanidine moiety in which one of
the amino hydrogens is substituted by a methyl group. Endogenous
methylguanidine is produced by conversion from creatinine and some
Fig. 2. Results of LDI-MSI analysis of the surface of the bladder cancer (BC) specimens on
109
AgNPET. The left sides of the individual metabolite panel (A–F) present
ion images (TIC normalization) for ions of m/z as stated below each image. The right sides contain plots of distribution of abundance values of metabolite in control
and cancer samples with optimal cut-off as a horizontal dashed line. All ion images are within 0.05 m/z.
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
42
amino acids [46]. Previous studies reported the potential toxicity of
methylguanidine [47]. Methylguanidine was proposed as a serum po-
tential biomarker of pancreatic cancer based on LC/GC–MS analyses
which revealed a higher abundance of this compound in serum of pa-
tients with this tumor compared to controls [48]. Higher level of meth-
ylguanidine was also observed in serum of patients with
cholangiocarcinoma [49]. This metabolite was identified in higher con-
centration in urine samples from patients with chronic pancreatitis by
NMR-based metabolomics [50]. Significantly increased level of methyl-
guanidine was identified in urine samples from dogs with BC compared
to controls in an NMR-based metabolomics study [51].
Ion images presenting higher average intensity in the area of normal
tissue were recorded for proton adduct of myosmine (m/z 147.092;
Fig. 2F). Myosmine is a derivative of pyridines which can be found in
tobacco and in various foods. It is suspected that this compound may be
related to esophageal cancer [52]. Ion assigned to potassium adduct of
ethylphosphate (m/z 164.971; Fig. 2 D) was found in higher intensity in
normal tissue compared to cancer tissue. Ethylphosphate is an organic
compound that belongs to the class of monoalkyl phosphates. This
compound was identified in human saliva by LC-MS [53]. Also, the ion of
m/z 102.091 (Fig. 3 B) was found in higher abundance in normal tissue
and was assigned to [MþH]
þ
adduct of aminopentanal.
Ion image that shows higher intensity in the area of cancer tissue has
been created for the m/z 217.924 which corresponds to the
109
Ag adduct
of hypotaurine (Fig. 2B). Hypotaurine is a sulfinic acid that is an inter-
mediate in the biosynthesis of taurine from cysteine sulphinic acid.
Previous research has established that hypotaurine has antioxidant
properties in vivo [54] and also acts as a neurotransmitter [55]. Previ-
ously, using
1
H NMR, hypotaurine was found in increased level in serum
samples of BC patients resistant to neoadjuvant chemotherapy [56].
Elevated level of hypotaurine was found in saliva of patients with
medication-related osteonecrosis of the jaw [57]. In addition, hypo-
taurine was found to be upregulated in tissue of patients with colorectal
cancer and related to the progression of this tumor [58].
4.2. Pathway analysis
A metabolic pathway impact analysis was performed to identify the
most relevant pathways involved in the observed changes of tissue
metabolite levels. Ten most significant metabolites were subjected to
pathway analysis and quantitative pathway enrichment analysis. Three
of them were found to be relevant to human metabolism (Table 2).
Seventeen metabolic pathways i.e., glyoxylate and dicarboxylate meta-
bolism, aminoacyl-tRNA biosynthesis, D-glutamine and D-glutamate
metabolism, nitrogen metabolism, taurine and hypotaurine metabolism,
arginine biosynthesis, glutathione metabolism, alanine, aspartate and
glutamate metabolism, porphyrin and chlorophyll metabolism, glycine,
serine and threonine metabolism, pyrimidine metabolism, primary bile
acid biosynthesis, purine metabolism, mercaptopurine action pathway,
thioguanine action pathway, azathioprine action pathway and mercap-
topurine metabolism pathway, were found to be significantly impacted
when comparing BC to normal tissue. Results from pathway impact
analysis are shown in Supplementary Tables S3 and S4. Glycine,
Fig. 3. Results of LDI-MSI analysis of the surface of the bladder cancer (BC) specimens on
109
AgNPET. (A–D) The left sides of the individual metabolite panel (A–D)
present ion images (TIC normalization) for ions of m/z as stated below each image. The right sides contain plots of distribution of abundance values of metabolite in
control and cancer samples with optimal cut-off as a horizontal dashed line. All ion images are within 0.05 m/z.
Table 2
Selected metabolites and their involvement in different pathways.
Compound
name
Pathway involved
Glycine Glyoxylate and dicarboxylate metabolism, aminoacyl-tRNA
biosynthesis, glutathione metabolism, porphyrin and chlorophyll
metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, primary
bile acid biosynthesis, mercaptopurine action pathway,
thioguanine action pathway, azathioprine action pathway
Glutamine Glyoxylate and dicarboxylate metabolism, aminoacyl-tRNA
biosynthesis, D-glutamine and D-glutamate metabolism, nitrogen
metabolism, arginine biosynthesis, alanine, aspartate and
glutamate mercaptopurine action pathway metabolism,
pyrimidine metabolism, purine metabolism, thioguanine action
pathway, azathioprine action pathway, mercaptopurine
metabolism pathway
Hypotaurine Taurine and hypotaurine metabolism
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
43
glutamine and hypotaurine were found to be involved in these metabolic
pathways (Table 2). These pathways are well known to be related to
cancer, e.g. taurine and hypotaurine metabolism have been shown to be
related to BC [59,60] and renal cell carcinoma [61], sulfur metabolism
has been shown to be related to breast cancer [62], and aminoacyl-tRNA
biosynthesis pathway has been shown to be related to prostate cancer
[63].
4.3. Diagnostic value of nanoparticles for MSI of cancer tissues
The diagnosis of most cancers is based on a molecular pathology that
is currently most often performed by immunohistochemical analysis
(IHC) or fluorescence in situ hybridization (FISH) which most often uses
macromolecules such as proteins or nucleic acids of varying lengths [64,
65]. These methods are complex, time-consuming, and require special-
ized and expensive antibodies or labeling. Surgical excision of the
bladder tumor is currently a method of choice for treating patients
suffering from BC, therefore it is important to quickly and precisely
define the neoplastic tissue border during surgery in order to completely
remove the tumor without damaging normal tissue. Numerous previous
studies have shown that metabolites enable a more precise determination
of pathology and may serve as potential diagnostic biomarkers in a va-
riety of malignancies [66]. The use of MSI allows not only to identify
potential tumor biomarkers but also to determine their location on the
surface of the examined tissue. Nowadays almost all of MSI is made with
the use of MALDI with many of its drawbacks including (i) abundant and
numerous chemical background peaks in the low-mass region (m/z <
1000) due to the presence of the applied matrix; (ii) the frequent need for
external mass calibration; (iii) low mass resolution and accuracy due to
the thickness of the tissue samples; (iv) low ionization efficiency for
many organic compounds present in the samples in their non-charged
states; (v) inhomogeneous matrix crystallization; and (vi) commonly
observed acid-catalyzed hydrolysis of various biomolecules, and thus it is
not suitable for metabolites. On the other hand, some nanoparticles such
as silver and gold-based lacks most of above mentioned MALDI draw-
backs and are one of the most interesting choices for studying of differ-
entiation between cancer and normal tissues.
5. Conclusion
In this study, LDI-MSI technique with the use of nanoparticle-
enhanced SALDI-type
109
AgNPET target was used for MSI of human
bladder tissue. Ion images produced for few dozens of compounds of
interest presented attention-grabbing differentiation of intensities. Uni-
variate and multivariate statistical analyses revealed 10 metabolites that
differentiated cancer from normal tissues. Among these metabolites,
glycine, 3-methylbutanal, ethylphosphate, glutamine, myosmine,
PI(22:0/0:0), aminopentanal, proline betaine and methylguanidine were
found in higher abundance in normal tissue samples and hypotaurine was
found at a higher level in cancer tissue samples. These compounds may
significantly increase diagnostic potential and serve as useful discrimi-
nators of cancerous versus normal tissues in patients diagnosed with BC.
Published results demonstrate that nanoparticle-based LDI-MSI must be
considered as a powerful tool for analysis of biological objects and
especially for biomarker discovery.
Financial disclosure
This work was supported by the National Science Centre (NCN),
SONATA grant no. UMO-2018/31/D/ST4/00109.
The author contributions
Study design: Krzysztof Ossoli
nski Tomasz Ruman, Joanna Nizioł.
Data collection: Joanna Nizioł, Adrian Arendowski, Aneta Płaza-
Altamer, Krzysztof Ossoli
nski, Anna Ossoli
nska, Tadeusz Ossoli
nski.
Statistical Analysis: Joanna Nizioł.
Data interpretation: Joanna Nizioł, Tomasz Ruman.
Manuscript preparation: Joanna Nizioł, Krzysztof Ossoli
nski, Artur
Kołodziej, Tomasz Ruman.
Literature Search: Joanna Nizioł, Krzysztof Ossoli
nski.
Funds Collection: Joanna Nizioł.
Declaration of competing interest
The authors declare no conflict of interests.
Acknowledgements
Mr Dominik Ruman is acknowledged for creating MS search engine of
chemical compounds.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data to this article can be found online at https://
doi.org/10.1016/j.advms.2022.12.002.
References
[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global
cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide
for 36 cancers in 185 countries. CA A Cancer J Clin 2021;71:209–49. https://
doi.org/10.3322/CAAC.21660.
[2] Kamat AM, Hegarty PK, Gee JR, Clark PE, Svatek RS, Hegarty N, et al. ICUD-EAU
international consultation on bladder cancer 2012: screening, diagnosis, and
molecular markers. Eur Urol 2013;63:4–15. https://doi.org/10.1016/
J.EURURO.2012.09.057.
[3] Gonz
alez de Vega R, Clases D, Fern
andez-S
anchez ML, Eir
o N, Gonz
alez LO,
Vizoso FJ, et al. MMP-11 as a biomarker for metastatic breast cancer by
immunohistochemical-assisted imaging mass spectrometry. Anal Bioanal Chem
2019;411:639–46. https://doi.org/10.1007/s00216-018-1365-3.
[4] Paine MRL, Kooijman PC, Fisher GL, Heeren RMA, Fern
andez FM, Ellis SR.
Visualizing molecular distributions for biomaterials applications with mass
spectrometry imaging: a review. J Mater Chem B 2017;5:7444–60. https://doi.org/
10.1039/C7TB01100H.
[5] Steurer S, Singer JM, Rink M, Chun F, Dahlem R, Simon R, et al. MALDI
imaging–based identification of prognostically relevant signals in bladder cancer
using large-scale tissue microarrays. Urol Oncol Semin Orig Investig 2014;32:
1225–33. https://doi.org/10.1016/J.UROLONC.2014.06.007.
[6] Ifa DR, Wiseman JM, Song Q, Cooks RG. Development of capabilities for imaging
mass spectrometry under ambient conditions with desorption electrospray
ionization (DESI). Int J Mass Spectrom 2007;259:8–15. https://doi.org/10.1016/
J.IJMS.2006.08.003.
[7] Sekuła J, NiziołJ, Rode W, Ruman T. Gold nanoparticle-enhanced target (AuNPET)
as universal solution for laser desorption/ionization mass spectrometry analysis and
imaging of low molecular weight compounds. Anal Chim Acta 2015;875:61–72.
https://doi.org/10.1016/J.ACA.2015.01.046.
[8] NiziołJ, Rode W, Zieli
nski Z, Ruman T. Matrix-free laser desorption–ionization with
silver nanoparticle-enhanced steel targets. Int J Mass Spectrom 2013;335:22–32.
https://doi.org/10.1016/J.IJMS.2012.10.009.
[9] NiziołJ, Rode W, Laskowska B, Ruman T. Novel monoisotopic 109AgNPET for laser
desorption/ionization mass spectrometry. Anal Chem 2013;85:1926–31. https://
doi.org/10.1021/ac303770y.
[10] NiziołJ, Ruman T. Surface-transfer mass spectrometry imaging on a monoisotopic
silver nanoparticle enhanced target. Anal Chem 2013;85. https://doi.org/10.1021/
ac4031658.
[11] NiziołJ, Ossoli
nski K, Ossoli
nski T, Ossoli
nska A, Bonifay V, Sekuła J, et al. Surface-
Transfer mass spectrometry imaging of renal tissue on gold nanoparticle enhanced
target. Anal Chem 2016;88. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b01859.
[12] Arendowski A, NiziołJ, Ossoli
nski K, Ossoli
nska A, Ossoli
nski T, Dobrowolski Z,
et al. Laser desorption/ionization MS imaging of cancer kidney tissue on silver
nanoparticle-enhanced target. Bioanalysis 2018;10:83–94. https://doi.org/
10.4155/bio-2017-0195.
[13] Moch H, Cubilla AL, Humphrey PA, Reuter VE, Ulbright TM. The 2016 WHO
classification of tumours of the urinary system and male genital organs—Part A:
renal, penile, and testicular tumours. Eur Urol 2016;70:93–105. https://doi.org/
10.1016/J.EURURO.2016.02.029.
[14] Sauter G, Algaba F, Amin MB, Busch C, Cheville J, Gasser T, et al. Tumours of the
urinary system: non-invasive urothelial neoplasias. In: WHO classification of
classification of tumours of the urinary system and male genital organs. IARCC
Press Lyon; 2004. p. 89–157.
[15] Suckau D, Resemann A, Schuerenberg M, Hufnagel P, Franzen J, Holle A. A novel
MALDI LIFT-TOF/TOF mass spectrometer for proteomics. Anal Bioanal Chem 2003;
376:952–65. https://doi.org/10.1007/s00216-003-2057-0.
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
44
[16] Bemis KD, Harry A, Eberlin LS, Ferreira C, van de Ven SM, Mallick P, et al. Cardinal
: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging
experiments. Bioinformatics 2015;31:2418–20. https://doi.org/10.1093/
bioinformatics/btv146.
[17] Pang Z, Chong J, Zhou G, De Lima Morais DA, Chang L, Barrette M, et al.
MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights.
Nucleic Acids Res 2021;49:W388–96. https://doi.org/10.1093/NAR/GKAB382.
[18] Patiny L, Borel A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical
infrastructure. J Chem Inf Model 2013;53:1223–8. https://doi.org/10.1021/
ci300563h.
[19] Arendowski A, NiziołJ, Ruman T. Silver-109-based laser desorption/ionization
mass spectrometry method for detection and quantification of amino acids. J Mass
Spectrom 2018;53:369–78. https://doi.org/10.1002/jms.4068.
[20] Luehr TC, Koide EM, Wang X, Han J, Borchers CH, Helbing CC. Metabolomic
insights into the effects of thyroid hormone on Rana [Lithobates] catesbeiana
metamorphosis using whole-body Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-
Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI). Gen Comp Endocrinol 2018;265:
237–45. https://doi.org/10.1016/J.YGCEN.2018.02.012.
[21] Duarte IF, Rocha CM, Barros AS, Gil AM, Goodfellow BJ, Carreira IM, et al. Can
nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy reveal different metabolic
signatures for lung tumours? Virchows Arch 2010;457:715–25. https://doi.org/
10.1007/s00428-010-0993-6.
[22] Cao M, Zhao L, Chen H, Xue W, Lin D. NMR-Based metabolomic analysis of human
bladder cancer. Anal Sci 2012;28:451–6. https://doi.org/10.2116/
ANALSCI.28.451.
[23] Owusu-Sarfo K M. Asiago V, Deng L, Gu H, Wei S, Shanaiah N, et al. NMR-Based
metabolite profiling of pancreatic cancer n.d.
[24] Moreadith RW, Lehninger AL. The pathways of glutamate and glutamine oxidation
by tumor cell mitochondria. In: Role of mitochondrial NAD(P)þ-dependent malic
enzyme, 259; 1984. p. 6215–21.
[25] Costello LC, Franklin RB. ‘Why do tumour cells glycolyse?’: from glycolysis through
citrate to lipogenesis. Mol Cell Biochem 2005;280:1–8. https://doi.org/10.1007/
s11010-005-8841-8.
[26] Possemato R, Marks KM, Shaul YD, Pacold ME, Kim D, Birsoy K, et al. Functional
genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer.
Nature 2011;476:346–50. https://doi.org/10.1038/nature10350.
[27] Yoshioka Y, Tsutsumi T, Adachi M, Tokumura A. Altered phospholipid profile in
urine of rats with unilateral ureteral obstruction. Metabolomics 2009;5:429–33.
https://doi.org/10.1007/s11306-009-0167-1.
[28] Lee GK, Lee HS, Park YS, Lee JH, Lee SC, Lee JH, et al. Lipid MALDI profile classifies
non-small cell lung cancers according to the histologic type. Lung Cancer 2012;76:
197–203. https://doi.org/10.1016/J.LUNGCAN.2011.10.016.
[29] Marien E, Meister M, Muley T, Fieuws S, Bordel S, Derua R, et al. Non-small cell
lung cancer is characterized by dramatic changes in phospholipid profiles. Int J
Cancer 2015;137:1539–48. https://doi.org/10.1002/ijc.29517.
[30] Guo S, Wang Y, Zhou D, Li Z. Significantly increased monounsaturated lipids
relative to polyunsaturated lipids in six types of cancer microenvironment are
observed by mass spectrometry imaging. Sci Rep 2015;4:5959. https://doi.org/
10.1038/srep05959.
[31] Kang S, Lee A, Park YS, Lee SC, Park SY, Han SY, et al. Alteration in lipid and
protein profiles of ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer 2011;21:1566–72. https://
doi.org/10.1097/IGC.0b013e318226c5f5.
[32] Mirnezami R, Spagou K, Vorkas PA, Lewis MR, Kinross J, Want E, et al. Chemical
mapping of the colorectal cancer microenvironment via MALDI imaging mass
spectrometry (MALDI-MSI) reveals novel cancer-associated field effects. Mol Oncol
2014;8:39–49. https://doi.org/10.1016/j.molonc.2013.08.010.
[33] Goto T, Terada N, Inoue T, Kobayashi T, Nakayama K, Okada Y, et al. Decreased
expression of lysophosphatidylcholine (16:0/OH) in high resolution imaging mass
spectrometry independently predicts biochemical recurrence after surgical
treatment for prostate cancer. Prostate 2015;75:1821–30. https://doi.org/10.1002/
pros.23088.
[34] Lin L, Huang Z, Gao Y, Chen Y, Hang W, Xing J, et al. LC-MS-based serum metabolic
profiling for genitourinary cancer classification and cancer type-specific biomarker
discovery. Proteomics 2012;12:2238–46. https://doi.org/10.1002/
pmic.201200016.
[35] Dill AL, Eberlin LS, Zheng C, Costa AB, Ifa DR, Cheng L, et al. Multivariate statistical
differentiation of renal cell carcinomas based on lipidomic analysis by ambient
ionization imaging mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 2010;398:2969–78.
https://doi.org/10.1007/s00216-010-4259-6.
[36] Dill AL, Eberlin LS, Costa AB, Zheng C, Ifa DR, Cheng L, et al. Multivariate statistical
identification of human bladder carcinomas using ambient ionization imaging mass
spectrometry. Chem Eur J 2011;17:2897–902. https://doi.org/10.1002/
chem.201001692.
[37] Bandu R, Mok HJ, Kim KP. Phospholipids as cancer biomarkers: mass spectrometry-
based analysis. Mass Spectrom Rev 2018;37:107–38. https://doi.org/10.1002/
mas.21510.
[38] Dill AL, Ifa DR, Manicke NE, Costa AB, Ramos-Vara JA, Knapp DW, et al. Lipid
profiles of canine invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder and
adjacent normal tissue by desorption electrospray ionization imaging mass
spectrometry. Anal Chem 2009;81:8758–64. https://doi.org/10.1021/ac901028b.
[39] Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, McDunn JE, Li Z, et al.
Bladder cancer biomarker discovery using global metabolomic profiling of urine.
PLoS One 2014;9:e115870. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115870.
[40] Pinto J, Amaro F, Lima AR, Carvalho-Maia C, Jer
onimo C, Henrique R, et al. Urinary
volatilomics unveils a candidate biomarker panel for noninvasive detection of clear
cell renal cell carcinoma. J Proteome Res 2021;20:3068–77. https://doi.org/
10.1021/ACS.JPROTEOME.0C00936/ASSET/IMAGES/LARGE/PR0C00936_
0004.JPEG.
[41] Hanai Y, Shimono K, Oka H, Baba Y, Yamazaki K, Beauchamp GK. Analysis of
volatile organic compounds released from human lung cancer cells and from the
urine of tumor-bearing mice. https://doi.org/10.1186/1475-2867-12-7; 2012.
[42] Zhu ZJ, Qi Z, Zhang J, Xue WH, Li LF, Shen ZB, et al. Untargeted metabolomics
analysis of esophageal squamous cell carcinoma discovers dysregulated metabolic
pathways and potential diagnostic biomarkers. J Cancer 2020;11:3944. https://
doi.org/10.7150/JCA.41733.
[43] Chen T, He P, Tan Y, Xu D. Biomarker identification and pathway analysis of
preeclampsia based on serum metabolomics. Biochem Biophys Res Commun 2017;
485:119–25. https://doi.org/10.1016/J.BBRC.2017.02.032.
[44] Chen Y, Xu J, Zhang R, Shen G, Song Y, Sun J, et al. Assessment of data pre-
processing methods for LC-MS/MS-based metabolomics of uterine cervix cancer.
Analyst 2013;138:2669–77. https://doi.org/10.1039/C3AN36818A.
[45] Oto J, Fern
andez-Pardo
A, Roca M, Plana E, Solmoirago MJ, S
anchez-Gonz
alez JV,
et al. Urine metabolomic analysis in clear cell and papillary renal cell carcinoma: a
pilot study. J Proteonomics 2020;218:103723. https://doi.org/10.1016/
J.JPROT.2020.103723.
[46] Perez G, Faluotico R. Creatinine: a precursor of methylguanidine. Export 1973 2912
1973;29:1473–4. https://doi.org/10.1007/BF01943863.
[47] Wang F, Yang B, Ling GH, Yao C, Jiang YS. Methylguanidine cytotoxicity on HK-2
cells and protective effect of antioxidants against MG-induced apoptosis in renal
proximal tubular cells in vitro, vol. 32; 2010. p. 85. https://doi.org/10.3109/
0886022X.2010.501935. Https://DoiOrg/103109/0886022X2010501935, 978.
[48] Xie G, Lu L, Qiu Y, Ni Q, Zhang W, Gao YT, et al. Plasma metabolite biomarkers for
the detection of pancreatic cancer. J Proteome Res 2015;14:1195–202. https://
doi.org/10.1021/PR501135F/SUPPL_FILE/PR501135F_SI_001.PDF.
[49] Suksawat M, Phetcharaburanin J, Klanrit P, Namwat N, Khuntikeo N, Titapun A,
et al. Metabolic phenotyping predicts gemcitabine and cisplatin chemosensitivity in
patients with cholangiocarcinoma. Front Public Health 2022;10:766023. https://
doi.org/10.3389/FPUBH.2022.766023/FULL.
[50] Lusczek ER, Paulo JA, Saltzman JR, Kadiyala V, Banks PA, Beilman G, et al. Urinary
1H-NMR metabolomics can distinguish pancreatitis patients from healthy controls.
JOP 2013;14:161.
[51] Zhang J, Wei S, Liu L, Nagana Gowda GA, Bonney P, Stewart J, et al. NMR-based
metabolomics study of canine bladder cancer. Biochim Biophys Acta, Mol Basis Dis
2012;1822:1807–14. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2012.08.001.
[52] Wilp J, Zwickenpflug W, Richter E. Nitrosation of dietary myosmine as risk factor of
human cancer. Food Chem Toxicol 2002;40:1223–8. https://doi.org/10.1016/
S0278-6915(02)00039-X.
[53]
Alvarez-S
anchez B, Priego-Capote F, Luque de Castro MD. Study of sample
preparation for metabolomic profiling of human saliva by liquid
chromatography–time of flight/mass spectrometry. J Chromatogr A 2012;1248:
178–81. https://doi.org/10.1016/J.CHROMA.2012.05.029.
[54] Aruoma OI, Halliwell B, Hoey BM, Butler J. The antioxidant action of taurine,
hypotaurine and their metabolic precursors. Biochem J 1988;256:251. https://
doi.org/10.1042/BJ2560251.
[55] Kalir A, Kalir HH. Biological activity of sulfinic acid derivatives. Sulphinic Acids,
Esters Deriv 2010:665–76. https://doi.org/10.1002/9780470772270.CH23.
[56] Cicero DO, Zhuang J, Yang X, Zheng Q, Li K, Cai L, et al. Metabolic profiling of
bladder cancer patients' serum reveals their sensitivity to neoadjuvant
chemotherapy. Metabolism 2022;12:558. https://doi.org/10.3390/
METABO12060558.
[57] Yatsuoka W, Ueno T, Miyano K, Uezono Y, Enomoto A, Kaneko M, et al.
Metabolomic profiling reveals salivary hypotaurine as a potential early detection
marker for medication-related osteonecrosis of the jaw. PLoS One 2019;14:
e0220712. https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0220712.
[58] Hou X, Hu J, Zhao X, Wei Q, Zhao R, Li M, et al. Taurine attenuates the hypotaurine-
induced progression of CRC via ERK/RSK signaling. Front Cell Dev Biol 2021;9:954.
https://doi.org/10.3389/FCELL.2021.631163/BIBTEX.
[59] Loras A, Su
arez-Cabrera C, Martínez-Bisbal MC, Quint
as G, Paramio JM, Martínez-
M
a~
nez R, et al. Integrative metabolomic and transcriptomic analysis for the study of
bladder cancer. Cancers 2019;11:1–36. https://doi.org/10.3390/cancers11050686.
[60] Loras A, Martínez-Bisbal MC, Quint
as G, Gil S, Martínez-M
a~
nez R, Ruiz-Cerd
a JL.
Urinary metabolic signatures detect recurrences in non-muscle invasive bladder
cancer. Cancers 2019;11:914. https://doi.org/10.3390/CANCERS11070914. 2019;
11:914.
[61] Yang W, Yoshigoe K, Qin X, Liu JS, Yang JY, Niemierko A, et al. Identification of
genes and pathways involved in kidney renal clear cell carcinoma. BMC Bioinf
2014;15:S2. https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-S17-S2.
[62] Ryu CS, Kwak HC, Lee KS, Kang KW, Oh SJ, Lee KH, et al. Sulfur amino acid
metabolism in doxorubicin-resistant breast cancer cells. Toxicol Appl Pharmacol
2011;255:94–102. https://doi.org/10.1016/J.TAAP.2011.06.004.
[63] Vellaichamy A, Sreekumar A, Strahler JR, Rajendiran T, Yu J, Varambally S, et al.
Proteomic interrogation of androgen action in prostate cancer cells reveals roles of
aminoacyl tRNA synthetases. PLoS One 2009;4:e7075. https://doi.org/10.1371/
journal.pone.0007075.
[64] Naumova AV, Modo M, Moore A, Murry CE, Frank JA. Clinical imaging in
regenerative medicine. Nat Biotechnol 2014 328 2014;32:804–18. https://doi.org/
10.1038/nbt.2993.
[65] Harris TJR, McCormick F. The molecular pathology of cancer. Nat Rev Clin Oncol
2010;7:251–65. https://doi.org/10.1038/NRCLINONC.2010.41.
[66] Baker M. Metabolomics: from small molecules to big ideas. Nat Methods 2011 82
2011;8:117–21. https://doi.org/10.1038/nmeth0211-117.
K. Ossoli
nski et al. Advances in Medical Sciences 68 (2023) 38–45
45
Original article
Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder
cancer
Krzysztof Ossoli
nski
a
, Tomasz Ruman
b
, Val
erie Copi
e
c
, Brian P. Tripet
c
,
Leonardo B. Nogueira
d
, Katiane O.P.C. Nogueira
e
, Artur Kołodziej
f
, Aneta Płaza-Altamer
f
,
Anna Ossoli
nska
a
, Tadeusz Ossoli
nski
a
, Joanna Nizioł
b
,
*
a
Department of Urology, John Paul II Hospital, 36-100, Kolbuszowa, Poland
b
Rzesz
ow University of Technology, Faculty of Chemistry, 35-959, Rzesz
ow, Poland
c
The Department of Chemistry and Biochemistry, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA
d
Department of Geology, Federal University of Ouro Preto, 35400-000, Ouro Preto, Brazil
e
Department of Biological Sciences, Federal University of Ouro Preto, 35400-000, Ouro Preto, Brazil
f
Doctoral School of Engineering and Technical Sciences at the Rzesz
ow University of Technology, 35-959, Rzesz
ow, Poland
article info
Article history:
Received 22 March 2022
Received in revised form
19 August 2022
Accepted 27 August 2022
Available online xxx
Keywords:
Bladder cancer
Biomarkers
Human serum
Metallomics
Metabolomics
abstract
Bladder cancer (BC) is one of the most frequently diagnosed types of urinary cancer. Despite advances in
treatment methods, no specific biomarkers are currently in use. Targeted and untargeted profiling of
metabolites and elements of human blood serum from 100 BC patients and the same number of normal
controls (NCs), with external validation, was attempted using three analytical methods, i.e., nuclear
magnetic resonance, gold and silver-109 nanoparticle-based laser desorption/ionization mass spec-
trometry (LDI-MS), and inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES). All results
were subjected to multivariate statistical analysis. Four potential serum biomarkers of BC, namely, iso-
butyrate, pyroglutamate, choline, and acetate, were quantified with proton nuclear magnetic resonance,
which had excellent predictive ability as judged by the area under the curve (AUC) value of 0.999. Two
elements, Li and Fe, were also found to distinguish between cancer and control samples, as judged from
ICP-OES data and AUC of 0.807 (in validation set). Twenty-five putatively identified compounds, mostly
related to glycans and lipids, differentiated BC from NCs, as detected using LDI-MS. Five serum metab-
olites were found to discriminate between tumor grades and nine metabolites between tumor stages.
The results from three different analytical platforms demonstrate that the identified distinct serum
metabolites and metal elements have potential to be used for noninvasive detection, staging, and grading
of BC.
©2022 The Author(s). Published by Elsevier B.V. on behalf of Xi’an Jiaotong University. This is an open
access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
1. Introduction
Bladder cancer (BC) is the tenth most commonly diagnosed
cancer in the world with approximately 570,000 new cases diag-
nosed each year. The incidence rate per 100,000 person per year
varies from 2.4 for women to 9.5 for men, and the mortality rate
varies from 0.86 for women to 3.3 for men [1]. Globally, urothelial
carcinoma (UC) identified histopathologically constitutes more
than 90% of all the cases of BC. In endemic regions such as Egypt
with a high prevalence of schistosomiasis infection, squamous cell
carcinoma (SCC) accounts for the majority of BC. However, control
over the Schistosoma haematobium infection has led to a shift from
SCC to UC being the most prevalent type of BC [2]. The remaining
10% includes exposure to aromatic amines, hydrocarbons, dyes,
some solvents, and coal tar [3]. The most common symptoms of BC
include macroscopic and microscopic hematuria. The mainstay for
BC diagnosis includes cystoscopy and urine cytology, and may
include ultrasound and computed tomography urography. Unfor-
tunately, cystoscopy is considered as an invasive procedure and the
sensitivity of urine cytology is low. Therefore, to reduce the number
of procedures, urinary markers have been proposed to track BC
recurrence [4,5]. These urinary markers are associated with higher
sensitivity, although at the expense of lower specificity, compared
with the accuracy of urine cytology. However, these markers have
*Corresponding author.
E-mail address: jniziol@prz.edu.pl (J. Nizioł).
Contents lists available at ScienceDirect
Journal of Pharmaceutical Analysis
journal homepage: www.elsevier.com/locate/jpa
https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004
2095-1779/©2022 The Author(s). Published by Elsevier B.V. on behalf of Xi’an Jiaotong University. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://
creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
Please cite this article as: K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
eet al., Metabolomic and elemental profiling of blood serum in bladder cancer, Journal
of Pharmaceutical Analysis, https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004
not been incorporated into clinical guidelines regarding the diag-
nosis and surveillance of BC. Therefore, there is a significant need
for noninvasive methods for the early detection of BC with high
sensitivity, specificity, and low cost.
Instrumental analyses of small molecules in biofluids, such as
blood, serum, and urine, are very powerful approaches to identify
and characterize diagnostic metabolic biomarkers. Metabolite
concentrations are reflective of the state of the organism and may
be the indicators of disease states including cancer states [6]. In the
past decade, numerous sensitive analytical methods have been
developed to allow the study of the metabolic state of living sys-
tem. The most frequently used analytical platforms for study of
metabolites are nuclear magnetic resonance (NMR) [7] and mass
spectrometry (MS), the latter usually coupled with liquid chro-
matography (LC) or gas chromatography (GC) [8e10].
Metabolomic methods have been used for study of BC with the
aim of identifying potential biomarkers in urine, serum, and tissues
[11,12]. The advantage of serum analysis is that it is much less
susceptible to the dilution factor compared to urine [13]. Although
from an application point of view, serum analysis is the best option,
the published data are very limited. A majority of reports of BC
serum metabolomics describe MS results. The first such study [14]
was focused on human serum profiling of BC with LC-MS, and the
authors proposed five potential biomarkers. Later, Zhou et al. [15]
applied GC-MS to perform plasma metabolomics analyses of 92
patients and 48 controls. The results identified increased levels of
metabolites associated with the pentose phosphate pathway, fatty
acid synthesis, and nucleotide metabolism in BC samples compared
with the controls. The authors focused on three metabolites that
could discriminate between the BC and control groups. In the
following years, several publications appeared that focused on
identifying potential biomarkers of BC using LC-MS [16e20] and
GC-MS [21,22]. To date, only three reports have reported metabolic
differences in serum within BC with NMR. The first NMR serum
metabolomics study of BC was published by Cao et al. [23]in2012,
and involved 67 BC patients and 25 healthy controls, and revealed a
few metabolites for which concentrations differed significantly
between these two groups. The metabolite changes were linked to
impacted pathways of lipogenesis, aromatic amino acid meta-
bolism, glycolysis, and the citrate cycle. In 2013, Bansal et al. [24]
applied proton nuclear magnetic resonance (
1
H NMR) spectroscopy
to compare 36 low-grade (LG) and 31 high-grade (HG) BC samples
with those of 32 healthy control patients. The study identified six
metabolites that could, together, serve as differentiating bio-
markers of LG versus HG BC. This same research team recently
reported the use of NMR to identify variations in the concentration
of previously selected potential serum BC biomarkers in 55 pre-
operative and 53 post-operative BC patients, and 152 controls [25].
Various studies have established the connection between levels
of metals, including trace-level metals and other trace elements,
with an increased risk of developing cancer in humans [26]. Toxic
elements are known risk factors for genetic and epigenetic effects,
which enhance the risk of developing different cancers [27].
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-
OES) has emerged as one of the most frequently used methods for
assessing the concentrations of metals in samples of biological
origin [28] including BC serum [29]. Studies recruited 27 BC pa-
tients, 29 non-tumor patients with acute and chronic inflamma-
tion, and 30 healthy control patients, who were divided into
validation and discovery cohorts. ICP-OES methods have also been
used in the search for biomarkers of other cancers, including kidney
cancer [30,31].
Herein, we report the results of the largest investigation to date,
comprising the targeted and non-targeted, elemental- and
metabolomics-based profiling of 200 serum samples obtained from
100 patients with BC and 100 healthy controls. This study has
enabled the elucidation of the detailed metabolic and elemental
changes resulting from BC, with a specific focus on the stage and
grade of BC. The analytical platforms used were high-resolution
1
H
NMR, ICP-OES, and high-resolution laser desorption/ionization MS
(LDI-MS), and the associated data were subjected to robust vali-
dation by multivariate and univariate statistical analyses.
2. Materials and methods
2.1. Materials and instruments
High-resolution LDI-MSI experiments were performed on
Autoflex Speed time-of-flight mass spectrometer (Bruker, Bremen,
Germany) with a declared resolution of >20,000 for m/z values of
>1,000 in positive-ion reflectron mode. The samples were placed
on a stainless-steel target with automatic pipette and then covered
by nebulization with a silver-109 nanoparticle (
109
AgNP) suspen-
sion generated by pulsed fiber laser (PFL) two-dimensional (2D)
galvoscanner (GS) laser synthesis in solution/suspension (LASiS)
and nebulization of
109
AgNPs (
109
AgNPs LDI-MS) as described in
our recent publication [32]. Gold nanoparticle (AuNP)-based LDI-
MS (AuNPs LDI-MS) was prepared analogically as described above
with the exception for PFL-2D GS LASiS material/substrate, which
was gold foil of 1 mm thickness. All solvents were of minimum LC-
MS grade and were acquired from Sigma Aldrich (St. Louis, MO,
USA). Deuterium oxide (D
2
O) and 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-
sulfonic acid were purchased from Sigma Inc. (Boston, MA, USA).
Nitric acid EMSURE ISO-grade 65% and hydrogen peroxide EMSURE
ACS ISO-grade 30% were purchased from Merck KGaA (Darmstadt,
Germany).
2.2. Collection of human serum samples
Serum samples were collected at John Paul II Hospital (Kolbus-
zowa, Poland). Control serum samples were collected from healthy
volunteers after a medical examination focused on the detection of
urinary cancers. Both types of serum samples from the original
NMR, MS, and ICP-OES datasets were randomly divided every time
into two groups, a training set, comprising 80% of all samples, and a
validation set, corresponding to 20% of all samples. All the patients
underwent transurethral resection of bladder tumor following
detailed clinical questioning and laboratory testing. The local
bioethics committee approved the study (Permission No.: 2018/04/
10). Just over half of the patients (n¼54) had LG BC and papillary
urothelial neoplasm of low malignant potential (PUNLMP) (n¼3),
whereas the remaining patient group exhibited HG disease
(n¼41). In two cases, both HG and LG neoplasms were detected.
Most of these patients (n¼69) displayed noninvasive papillary
carcinomas (pathologic stage Ta, pTa) stage disease, 19 had sub-
mucosal invasive tumors (pathologic stage T1 (pT1)) stage, and 12
patients had muscle invasive BC (pathologic stage T2 (pT2)). The
average age of patients diagnosed with BC and in the NC group was
74 ±10 and 64 ±12 years, respectively. The clinical characteristics
of the patients are presented in Table S1. A 2.6 mL of blood sample
was drawn from each participant and centrifuged (3,000 g, 10 min,
room temperature), then separated and kept at 60
C.
2.3. Preparation of serum metabolite extracts for
1
H NMR
metabolomics
Medium-to-high polarity metabolites were extracted from
serum samples as stated in our recent publication [33] and detailed
in Section S1 in the Supplementary data.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
2
2.4. Preparation of serum samples for LDI-MS studies
Serum samples were thawed at room temperature and diluted
500 times with methanol. Then, 0.3
m
L of serum sample was placed
directly on target plates (
109
Ag and Au PFL-2D GS LASiS [32]). After
the solvent was evaporated in air, the plates with the samples were
measured with Autoflex Speed apparatus.
2.5. Data processing and spectral acquisition
NMR and MS spectral acquisition and processing are shown in
the Supplementary data (Sections S2eS4).
2.6. ICP-OES analysis
Determination of the concentrations of Ca, Fe, K, Na, Mg, as well
as minor elements (Mn, P, and S) and trace elements (Cu and Zn) in
serum, was performed for 116 samples (65 BC and 51 NC) as stated
in our recent publication [31] and detailed in Section S5 in the
Supplementary data and Table S2.
2.7. Multivariate statistical analysis
All metabolite datasets were analyzed using the MetaboAnalyst
5.0 [34]. The statistical analysis approach presented in this publi-
cation is similar to one we previously presented [31] and another
unrelated study [35]; details are presented in the Supplementary
data (Section S6).
3. Results
In this work, we studied the metabolic profiles of BC in an effort
to propose serum-specific metabolic and/or elemental markers for
the specific detection of BC. Two hundred (100 BC and 100 normal
control (NC))
1
H NMR spectra were recorded of metabolite extracts
from patients and healthy control serum samples. Four hundred LDI
mass spectra were recorded with the use of
109
Ag and Au PFL-2D GS
LASiS targets. Additionally, 116 ICP-OES spectra of samples from 65
patients with BC and 51 NCs were studied.
3.1. Differences between BC and control serum by
1
H NMR
Two hundred extracts from sera (100 cancer and 100 control)
were analyzed with
1
H NMR spectroscopy. Overall, 39 compounds
were identified in each serum sample following standard protocols
[36,37]. An overlay of control and cancer NMR spectra, presented as
blue and red traces, respectively, in Figs. 1B and C, shows a relatively
high degree of similarity in the raw NMR data. These spectral re-
gions depict NMR signals observed from 3-hydroxybutyrate and
acetate metabolites, respectively. The intensity-normalized spectral
overlays shown in Figs. 1B and C clearly indicate that 3-
hydroxybutyrate levels (Fig. 1B) are higher and acetate levels (Fig.
1C) are lower in the serum profiles of patients with BC (red)
compared with healthy controls (blue). Detailed analysis of the
spectra indicated significant differences in metabolite levels be-
tween serum samples from patients with BC and healthy controls.
Metabolite concentration datasets obtained by NMR metab-
olomics were randomly divided into two subsets: a training dataset
to train the model (n¼80 BC and n¼80 NCs), and a validation
dataset to assess the validity and robustness of the trained model
(n¼20 BC and n¼20 NCs). Metabolite concentrations from both
datasets were subjected to statistical analyses to assess differences
in metabolite levels. The results of these analyses are summarized
in Tables S3 and S4. The 2D principal components analysis (PCA)
score plots of both subsets indicated good separation between the
cancer and the controls (Fig. 2A). In the validation set, separation
between cancer and control serum samples was also observed
along principal components 1 and 2 (Fig. 2B). The three-dimen-
sional (3D) PCA plots for training and validation sets are provided in
Figs. S1A and B.
A supervised multivariate analysis of the training set with the
aid of orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-
DA) indicated the strong separation of the BC and NC groups
(Fig. 2C). Two thousand permutation tests were conducted to
evaluate the statistical robustness of the OPLS-DA model (Figs. S2A
and B). Good discrimination was observed between the two groups
(Q
2
¼0.880, R
2
Y¼0.914, P<0.0005 (0/2000)), revealing significant
differences in the metabolic profiles of cancer versus control serum
samples. Group separations were observed with OPLS-DA in the
validation set (Fig. 2D) and were confirmed by the good results of
the permutation test (Q
2
¼0.780, R
2
Y¼0.932, P<0.0005 (0/2000))
(Figs. S2C and D). Potential serum BC biomarkers were selected on
the basis of the S-plot resulting from the OPLS-DA model. Variables
with |P(corr)| >0.5 were considered significant. Four variables
(acetate, propionate, pyroglutamate, and choline) were positively
correlated with the group separation, as determined by a P(corr) [1]
score of >0.5, while one metabolite (isobutyrate) negatively
correlated with the group separation, as assessed by P(corr)
[1]<0.5 (Fig. S1C). The S-plot of the OPLS-DA model in the
validation set confirmed almost all of the selected metabolites
(except for propionate) as the most significant for the differentia-
tion of the BC and NC groups (Fig. S1D). Finally, four metabolites
were identified as significant discriminators: acetate, pyrogluta-
mate, and choline, which all exhibited higher concentrations in the
sera of NCs, and isobutyrate, which was significantly elevated in the
sera of BC patients. The P-value of each variable was calculated
using independent t-tests and only variables with P-values and
false discovery rate <0.05 were considered significant. Metabolite
concentration information for a set of 39 significant metabolites is
presented in Tables S3 and S4. Next, univariate receiver operating
characteristic (ROC) curve analysis was separately performed on
both the training and validation sets to evaluate the diagnostic
ability of the models. The quality of the ranking represents the area
under the curve (AUC) above 0.7. The results indicated that in the
serum samples, all four previously selected metabolites (acetate,
choline, pyroglutamate, and isobutyrate) exhibited very high AUC
(above 0.82). The best ROC analyses with the highest significance
were obtained for isobutyrate (AUC ¼0.953, specificity ¼0.9, and
sensitivity ¼0.9), followed by pyroglutamate (AUC ¼0.894,
specificity ¼0.8, and sensitivity ¼0.9), propionate (AUC ¼0.859,
specificity ¼1.0, and sensitivity ¼0.7), choline (AUC ¼0.828,
specificity ¼0.8, and sensitivity ¼0.8), and acetate (AUC ¼0.824,
specificity ¼0.8, and sensitivity ¼1.0). The range of concentrations
compared to all these metabolites in the serum samples of cancer
patients compared to NCs is reported in Fig. S3. The most significant
results from our statistical analyses of compounds identified as
potential biomarkers of BC are presented in Table 1.
The classification ROC model was built with the use of Metab-
oAnalyst 5.0 online service and was based on a random forest al-
gorithm. As shown in Figs. 2E and F, the combination of levels of
these metabolites was a better discriminator (AUC >0.999) than
each metabolite separately in both data sets. An excellent
discriminating classification was found for four metabolites, i.e.,
acetate, propionate, choline, and isobutyrate, with an AUC of 0.999.
For this model, the confidence interval ranged from 0.994 to 1.000
(Fig. 2E). The validation of the ROC model is shown in Fig. S4 and a
permutation test with 1000 permutations yielded a P-value <
0.001, supporting the validity of the ROC analysis. The average of
the predicted class probabilities of each sample and the average
accuracy of the ROC curve demonstrated good classification
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
3
discriminatory power, with most of the samples classified accu-
rately in their respective groups. The results suggested that four
specific metabolites, namely, acetate, propionate, choline, and iso-
butyrate, could significantly increase diagnostic potential and serve
as useful discriminators of cancerous versus healthy phenotypes in
patients diagnosed with BC.
3.2. Differences between grades of BC with
1
H NMR
To determine whether metabolomics analysis of serum sam-
ples by
1
H NMR could help discriminate between different
grades of BCs, PCA and OPLS-DA analyses were performed on the
entire metabolite dataset. The analysis of BC included 95 serum
samples from patients with a uniquely defined grade of cancer;
three samples from patients with PUNLMP and two samples
from patients with tumor only partially classified as HG were
excluded. Finally, 41 serum extracts from patients with HG
cancer and 54 samples from patients with LG cancer were used
for analysis. The 2D and 3D PCA score plots, which revealed
relatively low discrimination between LG and HG cases with a
few outliers, are shown in Figs. S5A and B. Likewise, the OPLS-DA
score plots highlighted little separation between the HG and LG
cancer groups (Fig. S5C), yet yielded an acceptable P-value
(P¼0.002). The statistical significance of the model was exam-
ined using Q
2
(0.192) and permutation tests (n¼2000), which
yielded a P-value lower than 0.05. Detailed assessments of the
quality of the OPLS-DA model are shown in Fig. S6. The S-plot
analysis of the OPLS-DA model indicated that 15 metabolites
were significant contributors to the small separation observed
between LG vs. HG samples in the 2D and 3D OPLS-DA score plot
(Fig. S7). Of these 15 metabolites, leucine, histidine, alanine,
3-methyl-2-oxovalerate, tyrosine, phenylalanine, choline, tryp-
tophan, hypoxanthine, asparagine, valine, proline, threonine,
2-hydroxybutyrate, and glutamine were found to be positively
correlated with group separation with a P(corr) [1]score>0.5.
These biomarker candidates were subjected to a t-test to assess
the significance of altered levels in LG versus HG. All 15 me-
tabolites were found to exhibit statistically significant differences
in concentration (P<0.05; q <0.05 and |P(corr)| >0.5), sug-
gesting that examining the different levels of these metabolites
in human sera may be an effective way to identify LG and
discriminate LG from HG in patients with BC. AUC values for five
of the 15 metabolites were found to be greater than 0.74 (Fig. S8).
Additionally, ROC curve analysis of these five metabolites (i.e.,
leucine, histidine, alanine, 3-methyl-2-oxovalerate, and tyrosine)
only yielded a satisfactory AUC value of 0.775 (Fig. S9A), and a
Fig. 1. (A) Characteristic proton nuclear magnetic resonance (
1
H NMR) spectrum fragment (0.5e4.2 ppm) of a protein-free metabolite extract mixture obtained from serum sample
from a patient with BC, recorded on a 600 MHz (14 T) solution NMR spectrometer. Expanded NMR spectral regions, corresponding to
1
H chemical shift ranges of (B) 1.16e1.21 ppm
for 3-hydroxybutyrate and (C) 1.900e1.911 ppm for acetate, with a spectral overlay of 80 serum metabolic profiles obtained from healthy control patients depicted in blue (blue
spectral traces) and BC patients in red (red spectral traces).
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
4
valid permutation test with a P-value <0.001. The average ac-
curacy based on 100 cross validations amounted to a value of
0.693 (Fig. S9D). These analyses support that leucine, histidine,
alanine, 3-methyl-2-oxovalerate, and tyrosine may be good in-
dicators discriminating bladder tumor grades.
3.3. Differences between stages of BC identified by
1
H NMR
Analysis of tumor stages was also performed for the entire
1
H
NMR dataset of serum metabolite extracts. Metabolite profiling
analysis included 88 serum samples from patients with non-muscle
Fig. 2. Two-dimensional principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots of the tumor (violet) and control
(orange) serum samples in the (A and C) training set and (B and D) validation set for
1
H NMR data. The receiving operator characteristic (ROC) curves of the combination of four
differential metabolites, namely, isobutyrate, pyroglutamate, choline, and acetate, in the (E) training set and (F) validation set. AUC: area under the ROC curve; CI: confidence
interval; PC: principal component.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
5
invasive BC (pTa/pT1) and 12 serum samples from patients with
muscle invasive BC (pT2). Preliminary PCA analysis was performed
using the entire dataset of metabolite concentrations. PCA and
OPLS-DA score plots indicated relatively low separation between
the pTa/pT1 and pT2 stage of BC, with a few outliers that were
removed prior to the further OPLS-DA analysis. Figs. S5DeFcontain
the 2D, 3D-PCA, and OPLS-DA scores plots of the two groups that
were classified by BC grades. The quality factors for the OPLS-DA
model included Q
2
of 0.141 and R
2
Y of 0.347 and permutation test
P-value lower than 0.05 (Figs. S6C and D). The S-plot analysis of the
OPLS-DA model revealed the 12 serum metabolites that appeared
to be most relevant for sample differentiation between pTa/pT1 and
pT2 cancer grade: histidine, alanine, tryptophan, glutamine,
glycine, methylhistidine, choline, isobutyrate, threonine, phenyl-
alanine, leucine, and 3-methyl-2-oxovalerate (Fig. S7C). All those
compounds corresponded to |P(corr)|>0.05 and variable influence
on projection (VIP) >1.2 and were found to be at a higher con-
centration in the sera of patients with noninvasive pTa/pT1 BC stage
(Fig. S7D). However, the ROC analysis narrowed this group down to
nine metabolites with an AUC greater than 0.75: histidine, alanine,
tryptophan, glutamine, glycine, methylhistidine, choline, iso-
butyrate, and threonine. The ROC curve analysis of nine potential
biomarkers is shown in Fig. S10. For those nine selected metabo-
lites, a ROC curve analysis was performed to assess the performance
of this model in distinguishing between pTa/pT1 and pT2 BC stages,
and yielded an AUC value of 0.844, which indicated the good
discriminatory ability of the model (Fig. S9E). The permutation test
based on the measured area under the ROC curve (AUC) for that
model yielded a P-value <0.01 (Fig. S9F). The average of the pre-
dicted class probabilities of each sample across 100 cross valida-
tions and the associated permutation tests are shown in Figs. S9G
and H. Analysis of the changes in metabolite concentration for a
given stage of BC, i.e., pTa/pT1 versus pT2, reveals higher levels of
histidine, alanine, tryptophan, glutamine, glycine, methylhistidine,
choline, isobutyrate, and threonine in the serum samples of BC
patients with a pTa/pT1 stage of tumor compared to the sera of BC
patients with a pT2 stage tumor. The comparison of the three
groups of cancer stage (pT1 vs. pTa vs. pT2) did not reveal any
statistically significant differences.
3.4. Elemental profile of serum in BC determined by ICP-OES
The concentrations of chemical elements obtained from ICP-OES
analysis of 116 extracts of serum samples (65 BC and 51 NCs) were
subjected to statistical data analysis. A total of 12 elements were
identified and quantified. The mean concentration of each of these
elements is summarized in Tables S5 and S6. Prior to statistical
analysis, the data were randomly divided into two subsets: a
training set (control, n¼42 and cancer, n¼52) and a validation set
(control, n¼10 and cancer, n¼13). As shown in Fig. 3A, the PCA
score plot revealed a trend for separation between the two groups
in the training set. Results from the OPLS-DA analysis, shown in
Fig. 3B, provided a slightly clearer separation (compared to the PCA
analysis) between cancer and controls, and the validation param-
eters for the model were R
2
X and Q
2
values of 0.334 and 0.476,
respectively (Fig. S11). The analysis of the VIP scores of the OPLS-DA
model in the training set is presented at Fig. 3C.
Three elements (Cu, Fe, and Li) could be used to distinguish be-
tween the two groups of study participants; however, only two of
them (Cu and Fe) were confirmed to be the most significant dis-
criminators following model validation assessments (Fig. S12). The
loading S-plot of OPLS-DA of the training set revealed that Fe was
negatively correlated with group separation, with P(corr)
[1]<0.5, and indicated that a significantly higher level of this
element was found in the serum of patients diagnosed with BC
compared with the control group. Subsequently, Li was found to be
positively correlated with the group separation, with P(corr)
[1]>0.5, indicating that it was found in higher levels in the serum
samples of NCs. ROC analysis revealed that Fe was the most signifi-
cant, with an associated AUC value of 0.850, sensitivity of 0.8, and
specificity of 0.8, whereas for Li, the AUC value was 0.710, sensitivity
was 0.8, and specificity was 0.6. In addition, ROC curve analysis
assessing the performance of the ICP-OES model in distinguishing
between cancer and control samples was performed using only two
selected elements (Fe and Li). This analysis yielded an AUC value of
0.807 for the training set, which indicated good discriminatory po-
wer to separate the two (BC and NC) groups (Fig. 3D). The permu-
tation test yielded a significant P-value of <0.001. The average
accuracy amounted to a value of 0.728 (Fig. S13D).
Table 1
Summary of targeted quantitative analysis of potential biomarkers of BC from proton nuclear magnetic resonance (
1
H NMR) and inductively coupled plasma optical emission
spectrometry (ICP-OES) spectral analyses of serum samples (P-value <0.05; |P(corr)[1]| >0.5; area under the curve (AUC) >0.75).
Comparison mode Data set Metabolite/element AUC VIP [t] P(corr)[1]P-value
a
Fold change
b
Cancer vs. control
1
H NMR Isobutyrate 0.95 2.2 0.718 4.3 10
23
1.9
Pyroglutamate 0.89 1.9 0.626 7.8 10
18
0.5
Propionate 0.86 2.0 0.638 4.2 10
15
0.8
Choline 0.83 1.7 0.536 7.6 10
13
0.7
Acetate 0.82 2.3 0.729 1.6 10
12
0.4
ICP-OES Li 0.71 1.4 0.512 5.8 10
4
0.1
Fe 0.85 2.0 0.740 1.1 10
8
1.9
Low-grade vs. high-grade
1
H NMR Leucine 0.80 1.5 0.711 1.3 10
6
0.8
Histidine 0.79 1.7 0.830 2.2 10
6
0.7
Alanine 0.77 1.5 0.718 1.4 10
5
0.8
3-methyl-2-oxovalerate 0.77 1.4 0.690 2.2 10
5
0.6
Tyrosine 0.75 1.2 0.568 6.3 10
5
0.8
pTa/pT1 vs. pT2
1
H NMR Histidine 0.80 1.9 0.832 0.0001 1.9
Alanine 0.79 1.7 0.732 0.0002 1.6
Tryptophan 0.77 1.7 0.718 0.0002 1.6
Glutamine 0.77 1.5 0.645 0.0017 1.4
Glycine 0.75 1.4 0.593 0.0069 1.4
Methylhistidine 0.88 1.3 0.580 0.0094 2.1
Choline 0.88 1.3 0.566 0.0015 1.5
Isobutyrate 0.82 1.2 0.537 0.0021 1.4
Threonine 0.78 1.2 0.531 0.0009 1.3
a
P-value determined from Student's t-test.
b
Fold change between cancer and control serum calculated from the concentration mean values for each group; pTa: noninvasive papillary carcinomas; pT1: submucosal
invasive tumors; pT2: muscle invasive bladder cancer; VIP: variable influence on projection.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
6
These statistical analyses demonstrated that differential levels
of Fe and Li are potentially good indicators of BC in human serum.
The results from the statistical analyses of these two selected ele-
ments are summarized in Table 1.
3.5. Untargeted metabolic profiling by PFL-2D GS LASiS AuNPs and
109
AgNPs LDI-MS
In total, 335 and 650 features were detected in the serum
samples of 200 participants analyzed with PFL-2D GS LASiS AuNPs
and
109
AgNPs LDI-MS. Statistical analysis was performed using data
randomly divided into two subsets: a training set (n¼80 BC and
n¼80 NCs) and a validation dataset (n¼20 BC and n¼20 NCs).
2D-PCA and OPLS-DA score plots of mass spectral features
created for PFL-2D GS LASiS
109
AgNPs LDI-MS data revealed clear
discrimination between cancer and control serum samples in both
subsets (Fig. S14). The analysis of both subsets (training and vali-
dation set) indicated 216 common features with |p[1]| and |P(corr)|
above 0.5, of which 96 m/z values were more abundant in serum
from patients with BC compared with the control group, and 119
features displayed the opposite trend. The validation of the OPLS-
DA model using 2000 permutations resulted in R
2
Y and Q
2
values
of 0.986 (P<0.0005) and 0.982 (P<0.0005) (Fig. S15). All 11
previously selected m/z mass spectral features were found to
exhibit AUC values of >0.73. Figs. S16A and D indicate the
combination of m/z values, which is a better discriminator (AUC
>99% in the training and validation set) than independent evalua-
tion of each feature, which reinforces the improved capacity of
biomarker patterns to accurately distinguish between the BC and
NC groups. In the next step, putative identification of mass spectral
features was performed by searching various metabolite databases,
i.e., Human Metabolome Database [38], MetaCyc Metabolic
Pathway Database [39], LIPID MAPS®Lipidomics Gateway [40], and
Metlin [41]. Seventeen mass spectral features were putatively
identified as naturally occurring metabolites in the human body.
Important mass spectral features and annotated metabolite IDs
resulting from the PFL-2D GS LASiS
109
AgNPs LDI-MS analyses are
reported in Table S7. All statistical data with mean feature abun-
dance for control versus cancer serum samples based on PFL-2D GS
LASiS
109
AgNPs LDI-MS in the training and validation datasets are
presented in Tables S8 and S9.
The acquired data from untargeted PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-
MS analysis were also analyzed using PCA and OPLS-DA to identify
novel metabolites. In both cases, score plots showed clear separa-
tion in both subsets, suggesting that the PFL-2D GS LASiS AuNPs
LDI-MS-based serum metabolomics model could be used to iden-
tify BC (Fig. S17). The S-plots derived from the OPLS-DA model
using the training set (R
2
Y¼0.962, Q
2
¼0.955) and the validation
set (R
2
Y¼0.982, Q
2
¼0.964) generated a list of mass spectral
features (m/z) of interest that were found to be important for group
Fig. 3. Two-dimensional (A) principal component analysis and (B) orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots of the tumor (violet) and control
(orange) serum samples for ICP-OES data in the training set. (C) The potential discriminatory elements identified from the variable importance in projection (VIP) scores derived
from the OPLS-DA model in the training set. (D) The receiving operator characteristic (ROC) curves of the combination of two differential elements, Fe and Li. (E and F) The box-and-
whisker plots of Fe and Li level values observed in the control and BC serum samples. PC: principal component.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
7
discrimination (Fig. S18). All relevant mass spectral features are
reported in Tables S10 and S11. The analysis of both subsets
(training and validation sets) identified 172 common features with |
p[1]| and |P(corr)| above 0.5, of which 44 m/z values were more
abundant in the sera of BC patients compared to the control group,
and 128 features exhibited the opposite trend. This analysis was
followed by a multivariate ROC analysis. As shown in Fig. S19, the
combination of mass spectral features in both subsets was found to
be a more powerful discriminator between control and BC serum
samples (AUC >99%), compared with that of any individual mass
spectral feature.
The results presented above suggest that selected mass spectral
features can significantly increase the performance of the diag-
nostic model and can be used to distinguish cancer serum samples
from controls. Putative identifications of selected features allowed
for the identification of eight compounds that are often present in
the human body (Table S7).
3.6. Pathway analysis of potential cancer biomarkers
Metabolic pathway impact analysis suggested that 14 out of 25
metabolites identified in the NMR and LDI-MS analyses were
relevant to human metabolism. Seven pathways (glycine, serine
and threonine metabolism, glycerophospholipid metabolism,
propanoate metabolism, glutathione metabolism, pyruvate meta-
bolism, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, and glycolysis/
gluconeogenesis) were significantly impacted in BC compared with
the controls. The results from this pathway impact analysis are
shown in Fig. 4A and Table S12. The bubble area (Fig. 4A) reveals the
degree of impact on the pathway and the color represents the
significance (highest in red and lowest in white). Quantitative
enrichment analysis found 10 additional pathways relevant to BC,
i.e., amino sugar metabolism, aspartate metabolism, betaine
metabolism, ethanol degradation, fatty acid biosynthesis, methio-
nine metabolism, phosphatidylcholine biosynthesis, phosphati-
dylethanolamine biosynthesis, phospholipid biosynthesis, and
vitamin K (K1 and K2) metabolism (Fig. 4B and Table S13).
4. Discussion
In this study, NMR, ICP-OES, and LDI-MS with both
109
AgNPs and
AuNPs-based targets were employed to evaluate changes in serum
metabolite and element levels between patients with BC and con-
trols. BC is characterized by several metabolic changes that
promote cancer cell proliferation and thus tumor growth [42].
These changes in metabolism provide an essential source of energy
for intracellular metabolism and building blocks for rapidly
dividing tumor cells. The Warburg effect, a hallmark of cancer cell
metabolic activity, involves aerobic glycolysis in the presence of an
aerobic environment and fully functioning mitochondria, and relies
on increased glucose uptake and the conversion of glucose to
lactate. This type of energy gain for cancer cells is much less energy
efficient than mitochondrial respiration (2 adenosine triphosphate
(ATP) vs. 36 ATP respectively) [43]. However, studies have shown
that the rate of glucose-to-lactate conversion is 10e100 faster
compared with that of the complete mitochondrial oxidation of
glucose [44]. Moreover, the decoupling of glycolysis from oxidative
phosphorylation offers a biosynthetic advantage for cancer cells by
enabling the increased production of diverse biosynthetic pre-
cursors [45].
In this study, we investigated the serum metabolic profiles
among LG BC, HG BC, non-muscle invasive bladder cancer (pTa/
pT1), muscle invasive BC (MIBC, pT2), and healthy subjects. The
OPLS-DA modeling of the
1
H NMR metabolomics data revealed a
clear separation between the BC and control serum sample groups.
Metabolites with the highest AUC values (>0.82) included iso-
butyrate, pyroglutamate, propionate, choline, and acetate. The
differences in the concentration of pyroglutamate, acetate, propi-
onate, and choline were statistically significantly and higher in the
sera of healthy individuals, whereas isobutyrate concentrations
were much higher in the sera of BC patients.
Negative charges of short-chain fatty acids are considered to be
crucial metabolic and immune cell regulators [46]. Acetate plays a
key role in the metabolism of acetyl coenzyme A (acetyl-CoA),
bioenergetics, cell proliferation, and regulation [47]. In cells, acetate
is mainly used to generate acetyl-CoA through an ATP-dependent
reaction by acetyl-CoA synthetase. Tumor cells use acetate in the
form of acetyl-CoA, primarily for fuel or as a carbon source for lipid
synthesis [48]. Acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2), one of the en-
zymes capable of using acetate as a substrate, contributes to cancer
cell growth and is highly upregulated in multiple cancer types [49].
Based on these studies, we surmise that the lower levels of acetate
in the serum samples of patients with BC may be due to its sig-
nificant uptake and utilization by ACSS2 in cancer cells. Recently,
Lee et al. [50] reported that acetate in urine, along with four urine
metabolites, may contribute to the discrimination of different
urological cancers. Their research showed that acetate levels in
urine were slightly elevated in kidney cancer patients compared to
Fig. 4. Pathway topology analysis of statistically significant metabolites in BC that were found in the nuclear magnetic resonance and mass spectrometry (MS) datasets. (A) Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes pathway analysis. (B) Quantitative enrichment analysis based on Small Molecule Pathway Database.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
8
patients with bladder and prostate cancer. Unfortunately, these
results were not directly compared to those of a healthy control
group [50].
Other metabolites present at lower concentration in the sera of
BC cancer patients compared with healthy controls include choline
and propionate. Studies have shown that the consumption of
choline may protect against cancer [51]. Propionate, a metabolite
produced by the intestinal microbiota, reduces the proliferation of
cancer cells in the liver and the lungs [52,53]. Acetate and propio-
nate are the end-products of the indigestible carbohydrate
fermentation in the human colon, and are distributed systemically
via blood circulation. These compounds have been shown to exhibit
anti-inflammatory properties in immune cells, inhibit colon cancer
cell growth, and induce cancer cell death by apoptosis [53,54]. The
levels of serum propionate are also associated with circulating
immune cells in patients with multiple sclerosis, and lower serum
propionate levels were found in patients with multiple sclerosis
compared with the healthy controls [55]. In our study, the
increased absorption of propionate by cancer cells is reflected by
the lower propionate concentration in the sera of the patients with
BC. However, no study to date has focused on the role of propionate
in the progression of BC.
Choline is a water-soluble quaternary amine that is often
grouped with vitamin B owing to its chemical similarities, and is a
key nutrient for humans. This compound has various key functions
in the human body, especially with respect to neurochemical pro-
cesses [56]. Choline is involved in phospholipid production and
triglyceride metabolism, and is therefore necessary for the proper
structure and function of cell membranes. In this study, patients
with BC had lower serum levels of choline compared with the
controls, which could be a consequence of increased choline ab-
sorption by cancer cells. Our results are consistent with those of
other studies that have shown that cancer cells often increase the
synthesis of fatty acids; in turn, these can act as substrates for
phosphatidylcholine synthesis, which is increased in tumor cells
[57,58]. Furthermore, the increase in serum choline levels in cancer
patients is consistent with our previous study results, where
choline levels were found to be decreased in the sera of patients
with renal cell carcinoma compared with controls [59]. The oppo-
site situation was observed in urine, where urine choline levels
were increased in patients with BC [60,61].
Ohara et al. [62] revealed that isobutyrate exerted an anticancer
effect by suppressing the growth/metabolic networks supporting
colorectal cancer. Previously, Wang et al. [63] showed that the
levels of isobutyrate were lower in fecal samples of patients with
colorectal cancer compared to those of healthy control individuals.
To date, there is no report that isobutyrate is a potential biomarker
of BC. In our research, isobutyrate levels were found to be signifi-
cantly altered, as shown by the cancer-to-control mean concen-
tration (fold change) ratio of 1.9.
Pyroglutamate is a cyclized derivative of
L
-glutamate and is
related to the gamma-glutamyl cycle, which is the main pathway
for glutathione synthesis [64]. Glutathione is a major antioxidant
produced in the human body, the levels of which can drop
significantly as a result of oxidative stress or chemical exposure. In
the case of low glutathione levels, the level of pyroglutamate from
which it is reconstituted is also decreased [65]. Pyroglutamate was
found to be a promising biomarker for the diagnosis of nonalco-
holic liver disease [64]. Several studies have observed elevated
levels of pyroglutamate in the biofluids of patients with several
genetic disorders and an acetaminophen-induced metabolic dis-
order [66]. Most of the research devoted to urinary or serum
metabolomics of BC has suggested a higher level of pyroglutamate
in patients with BC compared with healthy controls [22,67].
However, both of these cited publications are based on GC-MS
results with derivatization, which can be considered inferior in
terms of quantitation compared to the measurement of unmodi-
fied extracts with NMR.
Fe is a crucial trace element in which the deficiency or excess is
associated with numerous disease states [68]. ICP-OES analysis
indicated an increase in serum Fe in patients with BC, which is
surprising, given that these patients often have micro/macro-
hematuria, so Fe deficiency would be expected [69]. However, the
higher level of Fe in serum of patients with BC may be explained by
the activation of mechanisms stimulating Fe absorption from the
gastrointestinal tract, which provides a possible compensation for
the level of Fe in the blood. Moreover, previous studies have sug-
gested that excess Fe in the sera of patients with cancer may be
associated with malignant transformation and cancer progression
[70]. In tumor tissues, rapid cell proliferation and increased DNA
synthesis are often observed, which require high Fe bioavailability.
In the human body, the main source of Fe in the blood is heme,
which is released following the breakdown of red blood cells [70].
Further, our results are consistent with earlier studies that reported
elevated serum Fe levels in various types of diseases, such as he-
patocellular carcinoma, lung cancer, and colorectal cancer [71].
Li is an alkali metal used to treat psychiatric disorders, and has
potential benefits for the treatment of leukemia or thyroid disor-
ders [72]. It inhibits several enzymes, including inositol mono-
phosphatase and glycogen synthase kinase-3 [73]. However, the
ingestion of Li causes many side effects, including hypercalcemia,
cardiovascular, and gastrointestinal and parathyroid disorders [74].
Recent studies demonstrated that Li uptake is associated with
reduced tumor incidence, probably through inhibited cell prolif-
eration, which may be linked to reduced DNA replication and S-
phase cell cycle arrest [75]. Wach et al. [29] detected significantly
increased concentration of Li in the sera of patients with BC
compared with healthy controls using ICP-OES.
Lower concentration of the serum amino acids histidine,
alanine, tryptophan, glutamine, glycine, and threonine in patients
with muscle invasive BC (pT2) in comparison to non-muscle inva-
sive BC (pTa/pT1) may suggest the higher uptake of these amino
acids and their potential role in protein synthesis underlying
muscle cancer invasion. This inference is supported by proteomic
studies that reported significant differences in tissue protein
expression, which were correlated with BC ability to invade into
muscle tissue [76]. Another possibility as to why these amino acids
are present at lower concentrations may be due to general state of
cachexia and malnutrition observed in patients with MIBC, which is
usually a systemic disease and often manifests at a stage when
metastases are present. Interestingly, lower concentrations of
serum amino acids (leucine, histidine, alanine, and tyrosine) can be
also observed in LG BC when compared to HG BC. In healthy or-
ganisms, de novo lipogenesis is limited to hepatocytes and adipo-
cytes. Cancer cells may reactivate this anabolic pathway, which
relies on glucose, glutamine, and acetate to synthesize citrate. Both
acetate and citrate are substrates for extramitochondrial acetyl-CoA
production, which is essential for fatty acid and cholesterol
biosynthesis [57].
To date, several papers have focused on metabolite analyses in
urine and blood from BC patients in an effort to potentially differ-
entiate the different grades of this cancer. However, to our
knowledge, only two studies have explored the relationships be-
tween changes in metabolite levels in urine and different tumor
stages (Ta/Tis, T1, and >T2) [61,77]. At present, there are no reports
of serum profiling in patients with different types of BC, probably
owing to the fact that this type of analysis would require quite a
large group of patients and healthy controls.
A pilot urine analysis conducted by Kim et al. [67]in2010
studied a relatively small group of patients and revealed slightly
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
9
elevated levels of alanine, glutamine, leucine, tyrosine, and glycine
and slightly decreased levels of threonine and tryptophan in pa-
tients with BC compared with controls. Subsequent studies also
using GC-MS confirmed higher levels of alanine in the serum of the
healthy controls compared to patients with BC, but the levels of
alanine were not found to be potentially diagnostic of BC stages
[22]. In our study, a slightly lower concentration of alanine in the
serum of patients with BC was found compared to the control
group; however, this trend was not found to be statistically sig-
nificant in differentiating between the two groups. However, we
measured significantly lower levels of alanine in the sera of patients
with LG and pTa/pT1 BC, which has not been previously reported in
the literature.
Troisi et al. [22] obtained comparable results to Kim et al. [67]
study with respect to glutamine level changes, but also found
higher levels of threonine in the sera samples from the LG group
compared with the HG group, and a higher level of glycine in the
HG group compared with the LG group. The results from our study
indicated that differential concentrations of glycine, glutamine, and
threonine in human sera may be used as diagnostic markers and
may help distinguish between different stages of BC, as we have
found that these metabolites were present at higher concentrations
in the sera of patients with pTa/pT1 stage disease compared to
those with pT2 stage. Bansal et al. [24] undertook an NMR-based
study of serum metabolite profiles and identified glutamine as
one of three metabolites that can differentiate between LG and HG
BC, as it was reported to be slightly elevated in the sera of patients
with HG BC [24]. Our results on serum glutamine levels are
consistent with published studies, and suggest that elevated levels
of glutamine in the pTa/pT1 stage of BC may be the result of
increased glutaminolysis, which is observed in some types of tu-
mors as an important mechanism to provide an additional source of
cellular energy [78].
Bansal et al. [24] also reported histidine as one of the six me-
tabolites that can distinguish patients with LG and HG BC from
healthy controls, and was reported to be in higher concentrations in
the sera of LG BC patients compared to HG BC patients and healthy
controls. The authors’finding about serum histidine levels was
consistent with that of our study, which found higher serum levels
of histidine in LG and pTa/pT1 BC cancer [24,79]. The link between
differential levels of serum histidine and BC progression, as well as
concentration changes in methylhistidine, tyrosine, leucine, and
tryptophan, has also been reported by Alberice et al. [80]. The au-
thors’study reported elevated levels of these metabolites in the
sera of patients with bladder tumors compared to those of patients
with early stages of BC [80]. In contrast, an LC-MS-based study
reported lower levels of histidine in the urine of patients with BC
compared to healthy controls [56,81]. Moreover, Li et al. [60]
indicated an increased level of
L
-methylhistidine in the urine of
patients with BC. Histidine is a precursor for histamine synthesis in
a reaction catalyzed by histidine decarboxylase (HDC). The over-
expression of HDC has been observed in various cancers. Histidine
via histamine is associated with inflammation in the urinary
bladder, which is commonly associated with cancer development
in this organ [82].
Our research has shown a significant difference in serum leucine
levels in BC patients with LG compared to HG. In addition to the
research of Kim et al. [67] and Alberice et al. [80], the level of
leucine in patients with BC was also examined by Cao et al. [23],
who reported, using NMR, lower levels of leucine/isoleucine as well
as tyrosine and glycine in the sera of patients with HG BC compared
to LG BC, which was consistent with our findings. Another study,
conducted by Loras et al. [83], reported increased levels of tyrosine
and tryptophan in the urine of patients with BC compared to
healthy controls. Our research results are also consistent with those
of Yumba Mpanga et al. [84], which indicated significantly higher
levels of tryptophan in the urine of patients with HG BC compared
to LG BC group.
The use of the gold and silver-109-modified targets in LDI-MS
experiments allowed for direct measurement of serum samples
without analyte separation and extraction. Using this technique,
serum analysis allowed the identification of 13 compounds that
were found in greater concentrations in control serum samples
compared to those of patients with BC, and 12 compounds that
displayed the opposite trend; these included three compounds
found independently using both silver-109- and gold-based MS
methods. Most of these compounds were lipids, 12 of which
belonged to the class of sphingolipids, and the remaining contained
fatty acyls, saccharolipids, polyketides, nucleosides or nucleotides,
and others.
Lipid metabolism plays a key role in various processes associ-
ated with cancer cells. Fatty acids are the building blocks of com-
plex lipids, which are used for energy storage or as building blocks
of cell membranes [85]. As reported by many authors, BC initiation
and progression are associated with changes in lipid metabolism
[86]. Sphingolipids are a group of lipids comprising sphingoid bases
(i.e., set of aliphatic amino alcohols that include sphingosine) that
play an important role in regulation of diverse cellular processes
including cellular apoptosis, proliferation, angiogenesis, senes-
cence, and transformation [87]. The importance of sphingolipids in
the regulation of cancer growth and pathogenesis has been well
described in the literature [88]. The sphingolipid metabolism may
be responsible for the invasion and mobility of cancer cells in
muscle-infiltrating BC [89]. Human BC cells have also been shown
to upregulate the cannabinoid receptors 2, which induces cell
apoptosis by stimulating de novo ceramide synthesis [90].
Lastly, the gold- and silver-109-based LDI-MS spectral analyses
shown in this work have indicated a higher concentration of serum
cyanidin in healthy individuals. Cyanidin is classified as a natural
antioxidant present in both fruits and vegetables, and has confirmed
with anticancer properties. It has been reported to induce apoptosis
and differentiation in prostate and renal cancer cells [91,92].
5. Conclusion
We demonstrate that high-resolution NMR, ICP-OES, and gold-
and silver-109-based LDI-MS, together with multivariate statistics,
are powerful sets of tools for the characterization of the serum
metabolome and elemental differences in BC. With regard to
biomarker discovery using
1
H NMR spectroscopy, four potentially
robust metabolic biomarkers were identified for 100 tumor serum
samples from patients with BC patients after comparison against
100 healthy controls owing to the excellent predictive ability of AUC
>0.999. Two elements (Fe and Li) exhibited significant concentra-
tion differences in the serum of NCs compared to that of patients
with BC, suggesting that they may serve as useful biomarkers of BC.
Additionally, 22 compounds (mainly lipids) were observed to
differentiate between cancer and control samples, as judged from
laser MS results. We also identified five metabolites that might be
used as potential biomarkers to distinguish LG and HG and nine
metabolites that may serve to differentiate between the pTa/pT1
and pT2 stages of BC. Our results suggest that differential serum
metabolite profiles and elements can help identify patients with BC
compared with NCs, with significant discriminating power between
different stages and grades of BC. Moreover, our findings demon-
strate that combining serum metabolite profiles and elements has a
stronger predictive value than either compound/element alone to
assess disease severity and progression in BC.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
10
CRediT author statement
Krzysztof Ossoli
nski: Investigation, Resources, Writing - Orig-
inal draft preparation; Tomasz Ruman: Methodology, Resources,
Data curation, Writing - Reviewing and Editing, Supervision;
Val
erie Copi
e: Resources, Data curation, Writing - Reviewing and
Editing, Funding acquisition; Brian P. Tripet: Resources, Data
curation, Writing - Reviewing and Editing, Visualization, Funding
acquisition; Leonardo B. Nogueira: Resources, Investigation, Data
curation; Writing - Original draft preparation; Katiane O.P.C.
Nogueira: Data curation, Writing - Original draft preparation;
Artur Kołodziej: Investigation, Data curation; Aneta Płaza-
Altamer: Investigation; Anna Ossoli
nska: Resources; Tadeusz
Ossoli
nski: Resources; Joanna Nizioł:Conceptualization, Meth-
odology, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing -
Original draft preparation, Reviewing and Editing, Visualization,
Supervision, Project administration, Funding acquisition.
Declaration of competing interest
The authors declare that there are no conflicts of interest.
Acknowledgments
Research was supported mainly by the National Science Center
(Poland) (Project SONATA No.: UMO-2018/31/D/ST4/00109).
1
H
NMR spectra were recorded at Montana State University (MSU),
Bozeman, USA, on a cryoprobe-equipped 600 MHz (14 T) AVANCE
III solution NMR spectrometer housed in MSU's NMR Center.
Funding for MSU NMR Center's NMR instruments has been pro-
vided in part by the National Institutes of Health Shared Instru-
mentation Grant program (Grant Nos.: 1S10RR13878 and
1S10RR026659), the National Science Foundation (Grant Nos: NSF-
MRI:DBI-1532078 and NSF-MRI CHE 2018388), the Murdock
Charitable Trust Foundation (Grant No.: 2015066:MNL), and sup-
port from the office of the Vice President for Research, Economic
Development, and Graduate Education at MSU.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data to this article can be found online at
https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.08.004.
References
[1] H. Sung, J. Ferlay, R.L. Siegel, et al., Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN
estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 coun-
tries, CA Cancer J. Clin. 71 (2021) 209e249.
[2] H.A.A. Amin, M.H. Kobaisi, R.M. Samir, Schistosomiasis and bladder cancer in
Egypt: Truths and myths, open access maced, J. Med. Sci. 7 (2019) 4023e4029.
[3] M. Burger, J.W. Catto, G. Dalbagni, et al., Epidemiology and risk factors of
urothelial bladder cancer, Eur. Urol. 63 (2013) 234e241.
[4] F.A. Yafi, F. Brimo, J. Steinberg, et al., Prospective analysis of sensitivity and
specificity of urinary cytology and other urinary biomarkers for bladder
cancer, Urol. Oncol. 33 (2015) 66.e25e66.e31.
[5] F. Soria, M.J. Droller, Y. Lotan, et al., An up-to-date catalog of available urinary
biomarkers for the surveillance of non-muscle invasive bladder cancer, World
J. Urol. 36 (2018) 1981e1995.
[6] Q. Yang, A.-H. Zhang, J.-H. Miao, et al., Metabolomics biotechnology, applica-
tions, and future trends: A systematic review, RSC Adv. 9 (2019)
37245e37257.
[7] G. Raja, Y. Jung, S.H. Jung, et al.,
1
H-NMR-based metabolomics for cancer
targeting and metabolic engineering eA review, Process Biochem. 99 (2020)
112e122.
[8] X.-W. Zhang, Q.-H. Li, Z.-D. Xu, et al., Mass spectrometry-based metabolomics
in health and medical science: A systematic review, RSC Adv. 10 (2020)
3092e3104.
[9] P.K. Cheung, M.H. Ma, H.F. Tse, et al., The applications of metabolomics in the
molecular diagnostics of cancer, Expert Rev. Mol. Diagn. 19 (2019) 785e793.
[10] Z. Pan, D. Raftery, Comparing and combining NMR spectroscopy and mass
spectrometry in metabolomics, Anal. Bioanal. Chem. 387 (2007) 525e527.
[11] K. Ng, A. Stenzl, A. Sharma, et al., Urinary biomarkers in bladder cancer: A
review of the current landscape and future directions, Urol. Oncol. 39 (2021)
41e51.
[12] R. Batista, N. Vinagre, S. Meireles, et al., Biomarkers for bladder cancer diagnosis
and surveillance: A comprehensive review, Diagnostics (Basel) 10 (2020), 39.
[13] M.C. Walsh, L. Brennan, J.P. Malthouse, et al., Effect of acute dietary stan-
dardization on the urinary, plasma, and salivary metabolomic profiles of
healthy humans, Am. J. Clin. Nutr. 84 (2006) 531e539.
[14] L. Lin, Z. Huang, Y. Gao, et al., LC-MS-based serum metabolic profiling for
genitourinary cancer classification and cancer type-specific biomarker dis-
covery, Proteomics 12 (2012) 2238e2246.
[15] Y. Zhou, R. Song, Z. Zhang, et al., The development of plasma pseudotargeted
GC-MS metabolic profiling and its application in bladder cancer, Anal. Bioanal.
Chem. 408 (2016) 6741e6749.
[16] G. Tan, H. Wang, J. Yuan, et al., Three serum metabolite signatures for diag-
nosing low-grade and high-grade bladder cancer, Sci. Rep. 7 (2017), 46176.
[17] D. Sahu, Y. Lotan, B. Wittmann, et al., Metabolomics analysis reveals distinct
profiles of nonmuscle-invasive and muscle-invasive bladder cancer, Cancer
Med. 6 (2017) 2106e2120.
[18] V. Vantaku, S.R. Donepudi, D.W.B. Piyarathna, et al., Large-scale profiling of
serum metabolites in African American and European American patients with
bladder cancer reveals metabolic pathways associated with patient survival,
Cancer 125 (2019) 921e932.
[19] C.S. Amara, C.R. Ambati, V. Vantaku, et al., Serum metabolic profiling identified
a distinct metabolic signature in bladder cancer smokers: A key metabolic
enzyme associated with patient survival, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.
28 (2019) 770e781.
[20] X. Liu, M. Zhang, X. Cheng, et al., LC-MS-based plasma metabolomics and
lipidomics analyses for differential diagnosis of bladder cancer and renal cell
carcinoma, Front. Oncol. 10 (2020), 717.
[21] Z. Lepara, O. Lepara, A. Fajki
c, et al., Serum malondialdehyde (MDA) level as a
potential biomarker of cancer progression for patients with bladder cancer,
Rom. J. Intern. Med. 58 (2020) 146e152.
[22] J. Troisi, A. Colucci, P. Cavallo, et al., A serum metabolomic signature for the
detection and grading of bladder cancer, Appl. Sci. 11 (2021), 2835.
[23] M. Cao, L. Zhao, H. Chen, et al., NMR-based metabolomic analysis of human
bladder cancer, Anal. Sci. 28 (2012) 451e456.
[24] N. Bansal, A. Gupta, N. Mitash, et al., Low- and high-grade bladder cancer
determination via human serum-based metabolomics approach, J. Proteome
Res. 12 (2013) 5839e5850.
[25] A. Gupta, K. Nath, N. Bansal, et al., Role of metabolomics-derived biomarkers
to identify renal cell carcinoma: A comprehensive perspective of the past ten
years and advancements, Expert Rev. Mol. Diagn. 20 (2020) 5e18.
[26] S.J. Mulware, Trace elements and carcinogenicity: A subject in review, 3
Biotech 3 (2013) 85e96.
[27] S. Mishra, S.P. Dwivedi, R.B. Singh, A review on epigenetic effect of heavy
metal carcinogens on human health, Open Nutraceuticals J. 3 (2010) 188e193.
[28] R.S. Amais, G.L. Donati, M.A. Zezzi Arruda, ICP-MS and trace element analysis
as tools for better understanding medical conditions, Trends Analyt. Chem.
133 (2020), 116094.
[29] S. Wach, K. Weigelt, B. Michalke, et al., Diagnostic potential of major and trace
elements in the serum of bladder cancer patients, J. Trace Elem. Med. Biol. 46
(2018) 150e155.
[30] M. Abdel-Gawad, E. Elsobky, M. Abdel-Hameed, et al., Quantitative and
qualitative evaluation of toxic metals and trace elements in the tissues of
renal cell carcinoma compared with the adjacent non-cancerous and control
kidney tissues, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 27 (2020) 30460e30467.
[31] J. Nizioł, V. Copi
e, B.P. Tripet, et al., Metabolomic and elemental profiling of
human tissue in kidney cancer, Metabolomics 17 (2021), 30.
[32] A. Płaza, A. Kołodziej, J. Nizioł, et al., Laser ablation synthesis in solution and
nebulization of silver-109 nanoparticles for mass spectrometry and mass
spectrometry imaging, ACS Meas. Sci. Au 2 (2022) 14e22.
[33] J. Nizioł, K. Ossoli
nski, B.P. Tripet, et al., Nuclear magnetic resonance and
surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based
metabolome profiling of urine samples from kidney cancer patients, J. Pharm.
Biomed. Anal. 193 (2021), 113752.
[34] Z. Pang, J. Chong, G. Zhou, et al., MetaboAnalyst 5.0: Narrowing the gap be-
tween raw spectra and functional insights, Nucleic Acids Res. 49 (2021)
W388eW396.
[35] S.Y. Ho, K. Phua, L. Wong, et al., Extensions of the external validation for
checking learned model interpretability and generalizability, Patterns (N Y) 1
(2020), 100129.
[36] A.H. Emwas, E. Saccenti, X. Gao, et al., Recommended strategies for spectral
processing and post-processing of 1D
1
H-NMR data of biofluids with a
particular focus on urine, Metabolomics 14 (2018), 31.
[37] L. Yu, I.W. Liou, S.W. Biggins, et al., Copper deficiency in liver diseases: A case
series and pathophysiological considerations, Hepatol. Commun. 3 (2019)
1159e1165.
[38] D.S. Wishart, D. Tzur, C. Knox, et al., HMDB: The human metabolome database,
Nucleic Acids Res. 35 (2007) D521eD526.
[39] R. Caspi, R. Billington, C.A. Fulcher, et al., The MetaCyc database of metabolic
pathways and enzymes, Nucleic Acids Res. 46 (2017) D633eD639.
[40] M. Sud, E. Fahy, D. Cotter, et al., LIPID MAPS-nature lipidomics Gateway: An
online resource for students and educators interested in lipids, J Chem. Educ.
89 (2012) 291e292.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
11
[41] C.A. Smith, G. O'Maille, E.J. Want, et al., METLIN A metabolite mass spectral
database, Ther. Drug Monit. 27 (2005) 747e751.
[42] F. Massari, C. Ciccarese, M. Santoni, et al., Metabolic phenotype of bladder
cancer, Cancer Treat. Rev. 45 (2016) 46e57.
[43] W. Jones, K. Bianchi, Aerobic glycolysis: Beyond proliferation, Front. Immunol.
6 (2015), 227.
[44] M.V. Liberti, J.W. Locasale, The Warburg effect: how does it benefit cancer
cells? Trends Biochem. Sci. 41 (2016) 211e218.
[45] M.G. Vander Heiden, L.C. Cantley, C.B. Thompson, Understanding the Warburg
effect: The metabolic requirements of cell proliferation, Science 324 (2009)
1029e1033.
[46] J. Frampton, K.G. Murphy, G. Frost, et al., Short-chain fatty acids as potential
regulators of skeletal muscle metabolism and function, Nat. Metab. 2 (2020)
840e848.
[47] S.A. Comerford, Z. Huang, X. Du, et al., Acetate dependence of tumors, Cell 159
(2014) 1591e1602.
[48] A.M. Hosios, M.G. Vander Heiden, Acetate metabolism in cancer cells, Cancer
Metabol. 2 (2014), 27.
[49] Z.T. Schug, J. Vande Voorde, E. Gottlieb, The metabolic fate of acetate in cancer,
Nat. Rev. Cancer 16 (2016) 708e717.
[50] S. Lee, J.Y. Ku, B.J. Kang, et al., A unique urinary metabolic feature for the
determination of bladder cancer, prostate cancer, and renal cell carcinoma,
Metabolites 11 (2021), 591.
[51] S. Sun, X. Li, A. Ren, et al., Choline and betaine consumption lowers cancer
risk: A meta-analysis of epidemiologic studies, Sci. Rep. 6 (2016), 35547.
[52] L.B. Bindels, P. Porporato, E.M. Dewulf, et al., Gut microbiota-derived propi-
onate reduces cancer cell proliferation in the liver, Br. J. Cancer 107 (2012)
1337e1344.
[53] K. Kim, O. Kwon, T.Y. Ryu, et al., Propionate of a microbiota metabolite induces
cell apoptosis and cell cycle arrest in lung cancer, Mol. Med. Rep. 20 (2019)
1569e1574.
[54] K.M. Maslowski, A.T. Vieira, A. Ng, et al., Regulation of inflammatory responses
by gut microbiota and chemoattractant receptor GPR43, Nature 461 (2009)
1282e1286.
[55] S. Trend, J. Leffler, A.P. Jones, et al., Associations of serum short-chain fatty
acids with circulating immune cells and serum biomarkers in patients with
multiple sclerosis, Sci. Rep. 11 (2021), 5244.
[56] S.K. Tayebati, I. Martinelli, M. Moruzzi, et al., Choline and choline alphoscerate
do not modulate inflammatory processes in the rat brain, Nutrients 9 (2017),
1084.
[57] N. Koundouros, G. Poulogiannis, Reprogramming of fatty acid metabolism in
cancer, Br. J. Cancer 122 (2020) 4e22.
[58] R.F. Saito, L.N.S. Andrade, S.O. Bustos, et al., Phosphatidylcholine-derived lipid
mediators: The crosstalk between cancer cells and immune cells, Front.
Immunol. 13 (2022), 768606.
[59] J. Nizioł, K. Ossoli
nski, B.P. Tripet, et al., Nuclear magnetic resonance and
surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based serum
metabolomics of kidney cancer, Anal. Bioanal. Chem. 412 (2020) 5827e5841.
[60] J. Li, B. Cheng, H. Xie, et al., Bladder cancer biomarker screening based on non-
targeted urine metabolomics, Int. Urol. Nephrol. 54 (2022) 23e29.
[61] A. Loras, C. Su
arez-Cabrera, M.C. Martínez-Bisbal, et al., Integrative metab-
olomic and transcriptomic analysis for the study of bladder cancer, Cancers 11
(2019), 686.
[62] T. Ohara, T. Mori, Antiproliferative effects of short-chain fatty acids on human
colorectal cancer cells via gene expression inhibition, Anticancer Res. 39
(2019) 4659e4666.
[63] X. Wang, J. Wang, B. Rao, et al., Gut flora profiling and fecal metabolite
composition of colorectal cancer patients and healthy individuals, Exp. Ther.
Med. 23 (2022), 250.
[64] S. Qi, D. Xu, Q. Li, et al., Metabonomics screening of serum identifies pyro-
glutamate as a diagnostic biomarker for nonalcoholic steatohepatitis, Clin.
Chim. Acta 473 (2017) 89e95.
[65] T.W. Sedlak, B.D. Paul, G.M. Parker, et al., The glutathione cycle shapes syn-
aptic glutamate activity, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 116 (2019) 2701e2706.
[66] J.A. Eckstein, G.M. Ammerman, J.M. Reveles, et al., Analysis of glutamine,
glutamate, pyroglutamate, and GABA in cerebrospinal fluid using ion pairing
HPLC with positive electrospray LC/MS/MS, J. Neurosci. Methods 171 (2008)
190e196.
[67] J.W. Kim, G. Lee, S.M. Moon, et al., Metabolomic screening and star pattern
recognition by urinary amino acid profile analysis from bladder cancer pa-
tients, Metabolomics 6 (2010) 202e206.
[68] A. Yiannikourides, G.O. Latunde-Dada, A short review of iron metabolism and
pathophysiology of iron disorders, Medicines (Basel) 6 (2019), 85.
[69] H. Mazdak, F. Yazdekhasti, A. Movahedian, et al., The comparative study of
serum iron, copper, and zinc levels between bladder cancer patients and a
control group, Int. Urol. Nephrol. 42 (2010) 89e93.
[70] R.A.M. Brown, K.L. Richardson, T.D. Kabir, et al., Altered iron metabolism and
impact in cancer biology, metastasis, and immunology, Front. Oncol. 10
(2020), 476.
[71] S.V. Torti, D.H. Manz, B.T. Paul, et al., Iron and cancer, Annu. Rev. Nutr. 38
(2018) 97e125.
[72] W. Young, Review of lithium effects on brain and blood, Cell Transplant. 18
(2009) 951e975.
[73] S.Y. Aghdam, S. Barger, Glycogen synthase kinase-3 in neurodegeneration and
neuroprotection: Lessons from lithium, Curr. Alzheimer Res. 4 (2007) 21e31.
[74] M. Kiełczykowska, M. Polz-Dacewicz, E. Kopciał, et al., Selenium prevents
lithium accumulation and does not disturb basic microelement homeostasis
in liver and kidney of rats exposed to lithium, Ann. Agric. Environ. Med. 27
(2020) 129e133.
[75] A. Sun, I. Shanmugam, J. Song, et al., Lithium suppresses cell proliferation by
interrupting E2F-DNA interaction and subsequently reducing S-phase gene
expression in prostate cancer, Prostate 67 (2007) 976e988.
[76] A. Latosinska, M. Mokou, M. Makridakis, et al., Proteomics analysis of bladder
cancer invasion: Targeting EIF3D for therapeutic intervention, Oncotarget 8
(2017) 69435e69455.
[77] J. Pinto,
^
A. Carapito, F. Amaro, et al., Discovery of volatile biomarkers for
bladder cancer detection and staging through urine metabolomics, Metabo-
lites 11 (2021), 199.
[78] M. Meng, S. Chen, T. Lao, et al., Nitrogen anabolism underlies the importance
of glutaminolysis in proliferating cells, Cell Cycle 9 (2010) 3921e3932.
[79] A. Gupta, N. Bansal, N. Mitash, et al., NMR-derived targeted serum metabolic
biomarkers appraisal of bladder cancer: A pre- and post-operative evaluation,
J. Pharm. Biomed. Anal. 183 (2020), 113134.
[80] J.V. Alberice, A.F. Amaral, E.G. Armitage, et al., Searching for urine biomarkers
of bladder cancer recurrence using a liquid chromatography-mass spec-
trometry and capillary electrophoresis-mass spectrometry metabolomics
approach, J. Chromatogr. A 1318 (2013) 163e170.
[81] K. Łuczykowski, N. Warmuzi
nska, S. Operacz, et al., Metabolic evaluation of
urine from patients diagnosed with high grade (HG) bladder cancer by SPME-
LC-MS method, Molecules 26 (2021), 2194.
[82] L. Graff, M. Frungieri, R. Zanner, et al., Expression of histidine decarboxylase
and synthesis of histamine by human small cell lung carcinoma, Am. J. Pathol.
160 (2002) 1561e1565.
[83] A. Loras, M. Trassierra, D. Sanjuan-Herr
aez, et al., Bladder cancer recurrence
surveillance by urine metabolomics analysis, Sci. Rep. 8 (2018), 9172.
[84] A. Yumba Mpanga, D. Siluk, J. Jacyna, et al., Targeted metabolomics in bladder
cancer: From analytical methods development and validation towards
application to clinical samples, Anal. Chim. Acta 1037 (2018) 188e199.
[85] C.R. Santos, A. Schulze, Lipid metabolism in cancer, FEBS J. 279 (2012)
2610e2623.
[86] M.Y. Lee, A. Yeon, M. Shahid, et al., Reprogrammed lipid metabolism in
bladder cancer with cisplatin resistance, Oncotarget 9 (2018) 13231e13243.
[87] H. Furuya, Y. Shimizu, T. Kawamori, Sphingolipids in cancer, Cancer Metastasis
Rev. 30 (2011) 567e576.
[88] B. Ogretmen, Sphingolipids in cancer: Regulation of pathogenesis and therapy,
FEBS Lett. 580 (2006) 5467e5476.
[89] S. Kawamura, C. Ohyama, R. Watanabe, et al., Glycolipid composition in
bladder tumor: A crucial role of GM3 ganglioside in tumor invasion, Int. J.
Cancer 94 (2001) 343e347.
[90] A. Bettiga, M. Aureli, G. Colciago, et al., Bladder cancer cell growth and motility
implicate cannabinoid 2 receptor-mediated modifications of sphingolipids
metabolism, Sci. Rep. 7 (2017), 42157.
[91] V. Sorrenti, L. Vanella, R. Acquaviva, et al., Cyanidin induces apoptosis and
differentiation in prostate cancer cells, Int. J. Oncol. 47 (2015) 1303e1310.
[92] X. Liu, D. Zhang, Y. Hao, et al., Cyanidin curtails renal cell carcinoma tumor-
igenesis, Cell. Physiol. Biochem. 46 (2018) 2517e2531.
K. Ossoli
nski, T. Ruman, V. Copi
e et al. Journal of Pharmaceutical Analysis xxx (xxxx) xxx
12
1
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports
Untargeted ultra‑high‑resolution
mass spectrometry metabolomic
proling of blood serum in bladder
cancer
Joanna Nizioł1*, Krzysztof Ossoliński2, Aneta Płaza‑Altamer3, Artur Kołodziej3,
Anna Ossolińska2, Tadeusz Ossoliński2 & Tomasz Ruman1
Bladder cancer (BC) is a common urological cancer of high mortality and recurrence rates. Currently,
cystoscopy is performed as standard examination for the diagnosis and subsequent monitoring
for recurrence of the patients. Frequent expensive and invasive procedures may deterrent patients
from regular follow‑up screening, therefore it is important to look for new non‑invasive methods
to aid in the detection of recurrent and/or primary BC. In this study, ultra‑high‑performance liquid
chromatography coupled with ultra‑high‑resolution mass spectrometry was employed for non‑
targeted metabolomic proling of 200 human serum samples to identify biochemical signatures that
dierentiate BC from non‑cancer controls (NCs). Univariate and multivariate statistical analyses
with external validation revealed twenty‑seven metabolites that dierentiate between BC patients
from NCs. Abundances of these metabolites displayed statistically signicant dierences in two
independent training and validation sets. Twenty‑three serum metabolites were also found to
be distinguishing between low‑ and high‑grade of BC patients and controls. Thirty‑seven serum
metabolites were found to dierentiate between dierent stages of BC. The results suggest that
measurement of serum metabolites may provide more facile and less invasive diagnostic methodology
for detection of bladder cancer and recurrent disease management.
Bladder cancer (BC) is the second most frequently diagnosed cancer of the urinary tract aer prostate cancer
in the world. In 2020, this disease aected over 473,000 individuals worldwide and was responsible for 212 536
deaths1. According to TNM Classication of Malignant Tumors system proposed by American Joint Committee
on Cancer (AJCC), bladder cancer can be classied according to whether the tumor inltrates into or out of the
muscular tissue as muscle-invasive bladder cancer (MIBC) and non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC)
respectively2. NMIBC is the most common type of BC and includes noninvasive papillary carcinomas (pathologic
stage Ta), submucosal invasive tumors (T1) and carcinoma insitu (CIS). MIBC includes tumor which extends
into the muscle (stage T2), into the perivisceral fat layer (stage T3) or nearby organs (stage T4). Statistically, in
case of 80% of patients tumor do not spread outside of the bladder wall. BC can also be classied by histology
as low-grade (LG) tumor that rarely spread from their primary site, and high-grade ones (HG) that are more
aggressive and invasive3.
Generally, the rst treatment for early BC is a trans urethral resection of bladder tumor (TURBT) sometimes
followed by intravesical instillation of mitomycin orBacillus Calmette-Guerin (BCG) therapy. On the other hand,
standard treatment for MIBC is a radical cystectomy with pelvic lymph-node dissection. is is combined with
neoadjuvant or adjuvant cisplatin based chemotherapy4. Despite such aggressive type of treatment, the survival
rate of bladder cancer patients is low. us, it is essential to combine local and systemic therapies to improve
outcomes. High-grade tumors are usually detected by cytology with high specicity and selectivity, but in the
case of low-grade tumors, their determination is very dicult.
Metabolomic instrumental analysis is powerful family of tools mainly oen used for study of biouids. Small
molecules levels in biouids such as serum reects the current state of the organism allowing for identication
and characterization of potential disease biomarkers. e number of metabolomics studies in the diagnosis and
OPEN
1Faculty of Chemistry, Rzeszów University of Technology, 6 Powstańców Warszawy Ave., 35-959 Rzeszow,
Poland. 2Department of Urology, John Paul II Hospital, Grunwaldzka 4 St., 36-100 Kolbuszowa, Poland. 3Doctoral
School of Engineering and Technical Sciences at the Rzeszów University of Technology, 8 Powstańców Warszawy
Ave., 35-959 Rzeszow, Poland. *email: jniziol@prz.edu.pl
2
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
understanding of many diseases is rapidly growing in recent years5. Numerous analytical methods have been
used to better understand the metabolic changes occurring in living systems and especially cancer phenotypic
changes. However, two analytical platforms including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy6 and
mass spectrometry (MS) oen coupled with liquid chromatography (LC)7 allow to achieve the most comprehen-
sive screening of cancer metabolomes. MS in comparison to NMR, allows the detection of much broader range of
compounds with much higher sensitivity, resolution, and precision using very small amount of sample8. Over the
past een years, metabolomic analytical methods have been used extensively to investigate BC and to identify
potential biomarkers of this cancer in urine, serum, and tissues9,10. Compared to urine, serum metabolomics
is less prone to be aected by dilution factor. Serum is also more readily available than tissue and procedure
less invasive11. Despite the advantages of examining the metabolomes of human sera, there are only a few stud-
ies on serum metabolomics focused on BC biomarker discovery. So far, most studies related to the analysis of
serum of patients with bladder cancer have been carried out using NMR12–14 or mass spectrometry coupled with
liquid7,15–19 and gas chromatography(GC)3,20,21. e rst such study of serum from BC patients with LC–MS is
from 2012, when Lin etal.22 analyzed serum proles of BC with LC–MS, and revealed ve potential biomarkers
for diagnosis of dierent types of genitourinary cancer. Five years later Tan etal. (Tan 2017) analyzed serum
metabolites of 120 BC patients and 52 healthy persons using ultrahigh performance liquid chromatography
(UHPLC) coupled withquadrupole time-of-ight (Q-TOF) mass spectrometry in conjunction with univariate
and multivariate statistical analyses. ey selected and validated 3 dierential metabolites including inosine,
acetyl-N-formyl-5-methoxykynurenamine and phosphatidylserine, PS(O-18:0/0:0) that could discriminate HG
and LG BC patients and also LG BC and healthy controls. In the same year, Sahu etal. applied GC and LC–MS
to identify metabolite associated with urothelial carcinoma in 72 patients and 7 patients without urothelial
neoplasia17. eir research indicated potential metabolic pathways altered in NMIBC and MIBC BC. In 2019,
Vantaku etal. presented serum targeted metabolomic analysis based on LC–MS to investigated to investigate
the molecular dierences in BC patients from dierent parts of the world. e study included two independent
cohorts of 54 European Americans and 18 African Americans patients and corresponding healthy controls16. In
the same year, Amara etal.15 applied LC–MS for targeted analysis of serum metabolites of 67 BC smokers and
53 post-operative BC patients and 152 healthy controls. eir research showed that serum analysis before and
aer tumor resection can reveal progressive and signicant changes of concentration of selected metabolites.
In 2021, Troisi etal. applied LC–MS to prole serum metabolites of 64 patients with BC, 74 patients with RCC,
and 141 healthy controls. ey used dierent ensemble machine learning models in order to identify metabolites
that dierentiate cancer patients from controls and allow to classify the tumor in terms of its stage and grade
(Troisi 2021).
In this work we report the rst results of untargeted analysis of human sera with ultra-high-resolution mass
spectrometry coupled to ultra-high-performance liquid chromatography. is study employed the large number
of patients—100 cancer patients and 100 controls. Untargeted analysis was focused on serum metabolic changes
generated by bladder cancer but also stratifying the disease by stage and grade. Our study reveals potential BC
biomarkers for early detection, screening and dierential diagnosis.
Materials and methods
All chemicals were of analytical reagent grade. Deionized water (18MΩcm) was produced locally. LC–MS-grade
methanol was bought from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Instrumentation. Instrumental conguration consisted of a Bruker Elute UHPLC system operated by
Hystar 3.3 soware and a ultra-high-resolution mass spectrometer Bruker Impact II (60,000+ resolution ver-
sion; Bruker Daltonik GmbH) ESI QTOF-MS equipped with Data Analysis 4.2 (Bruker Daltonik GmbH), and
Metaboscape (2021b). A Waters UPLC column ACQUITY BEH (C18 silica, 1.7μm particles, 50 × 2.1mm) with
compatible column guard was used for all analyses. Two mobile phases were: A = Water with 0.1% formic acid,
B = acetonitrile with 0.1% formic acid (v/v). Samples in autosampler were thermostated at 4°C temperature.
Volume of 5 μL of extract was loaded on the column at a ow rate of 200μL min−1, using 4% B. B percentage
was changed with time as follows: 0min—1%, 0.56min—1% B, 4.72min—99%, 5.56min—99%, 5.6min—1%,
9.45min—1%. Solvent ow was 450μL min−1. Column was thermostated at 40°C temperature. Internal calibra-
tion on 10mM sodium formate (water: isopropanol 1:1 v/v) ions was performed automatically in Metaboscape
with the use of syringe pump at an infusion ow rate of 0.12mL h−1, using a high precision calibration (HPC)
mode. Analyses in positive autoMSMS mode were carried out using the following parameters: m/z 50–1200;
capillary voltage: 4.5kV; nebulizer: 2.7bar; dry gas: 12L min−1; drying gas temperature: 220°C; hexapole volt-
age: 50 Vpp; funnel 1: 200 Vpp; funnel 2: 200 Vpp; pre-pulse storage time: 5μs; transfer time: 60μs. Collision-
Induced Dissociation (CID) was used with following settings: absolute threshold (per 100 sum): 200 cts; absolute
threshold 88 cts; active exclusion 3 spectra; release aer 0.3min, isolation mass: for m/z = 100, width was 3, for
500 width was 4, for 1000 was 6 and for 1300 was 8); collision energy value was 30eV. MS frequency was 20Hz
and MSMS from 5 to 30. e untargeted annotations were performed in Metaboscape (ver. 2021b) with a crite-
rion of mass deviation (Δm/z) under 2ppm and mSigma value under 15 as the maximum acceptable deviation
of the mass of the compound and the isotopic pattern respectively. For identication and molecular formula
generation, exact mass of parent ions was matched with < 3ppm error and mSigma value < 50 in most cases. All
the molecular formulas were obtained using the Smart Formula tool and the C, H, N, O, P, S, Cl, Br, I and F ele-
ments. MSMS spectra was automatically matched against MSMS libraries: Bruker HMDB 2.0 library, MassBank
of North America (MoNA)23 library and NIST ver. 2020 MSMS library24. e quality control (QC) sample were
prepared from 100 dierent serum extracts and were measured every ten samples throughout the analytical run
3
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
to provide a set of data from which method stability and repeatability can be assessed. All measurements were
made in technical triplicates.
Collection of human blood samples. Serum samples were collected from one hundred bladder can-
cer patients (average age 73, Caucasian race) at John Paul II Hospital in Kolbuszowa (Poland). Control serum
samples were collected from healthy volunteers aer medical examination focused on detection of urinary can-
cers. All the patients underwent transurethral resection of bladder tumor (TURBT) following detailed clinical
questioning and laboratory testing. e study was approved by local Bioethics Committee at the University
of Rzeszow (Poland, permission no. 2018/04/10) and performed in accordance with relevant guidelines and
regulations. All patients involved in the study were informed about the purpose of this research and planned
procedures, and signed an informed consent form. Just over half of the patients (n = 54) had low-grade bladder
cancer and papillary urothelial neoplasm of low malignant potential (PUNLMP) (n = 3), while the remaining
patient group exhibited high-grade disease (n = 41). In two cases, both high- and low-grade neoplasms were
detected. e majority of these patients (n = 69) displayed noninvasive papillary carcinomas (pathologic stage
Ta, pTa) stage disease, nineteen had submucosal invasive tumors (pathologic stage T1, pT1) stage and twelve
patients had muscle invasive bladder cancer (pathologic stage T2, pT2). e average age for diagnosed patients
with BC was 74 ± 10years while in NCs group the average age was 64 ± 12. e entire NCs group consists of
patients admitted to the urology department for surgical treatment of benign urological conditions (urolithiasis,
benign prostate hyperplasia, testicular hydrocele, varicocele, phimosis, ureteropelvic junction stenosis, urinary
incontinence, urethral stricture). Each of these patients has had performed at least an abdominal ultrasound to
rule out neoplasms (patients with urolithiasis usually also had a computed tomography (CT) scan) and a basic
bundle of lab tests required for urological surgery that rule out inammation. Patients were selected according
to a similar age range. Aer familiarizing patients with the research program, patients from the control group
gave written consent to donate residual serum for study (no additional blood was drawn for the purpose of this
study, except that taken before urological surgery). e clinical characteristics of the patients are presented in
supplementary information 1, tableS1. Approximately 2.6ml of blood was drawn from each participant. Sam-
ples were centrifuged at 3000rpm for 10min at room temperature. e serum was then separated and kept at
−60°C until further use.
Sample preparation. Polar metabolites were extracted from serum samples as described in our recent
publication (Nizioł, Ossoliński, etal. 2021). In brief, deep frozen blood plasma samples (300 µL) were thawed on
ice to 4°C before use. Samples were then centrifuged at 12,000×g for 5min also at 4°C temperature. Volume of
300µL of serum was pipetted into sterile 2.0mL Eppendorf tubes and room-temperature acetone (900µL) was
added and vial vortexed for 1min. Resulting suspension was incubated at room temperature for 20min followed
by 30min at − 20°C. Tubes was then centrifuged at 6000×g for 5min at 4°C temperature to sediment serum
precipitated proteins and phospholipids and then claried supernatant A (800µL) was transferred to a new 2ml
microcentrifuge tube. Volume of 500µL of a 3:1 acetone/H2O solution was added to the pellet and vortexed
vigorously until the pellet was resuspended, this tube was then centrifuged at 12,000×g for 10min at 4°C to
sediment serum precipitated proteins again. Resulting supernatant B was then combined with supernatant A.
Volume of 260 µL of combined supernatants were vacuum dried in speedvac-type concentrator and dissolved in
400 µL of methanol, vortexed and centrifuged (12,000×g for 5min at 4°C). Supernatant volume of 100 µL was
transferred into HPLC vial insert of 130 µL capacity and inserted into Elute autosampler.
Multivariate statistical analysis. All metabolite datasets exported from Metaboscape v.2021b were ana-
lyzed using the MetaboAnalyst 5.0 online soware25. Prior to analysis, data was log-transformed, auto-scaled
and normalized by sum. Resulting metabolite proles were then subjected to unsupervised Principal Compo-
nent Analysis (PCA). e separation between the BC and control groups observed in the 2D and 3D PCA scores
plot was further examined using the supervised multivariate statistical analysis such as Orthogonal Partial Least
Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA). e quality of the OPLS-DA models was assessed by the goodness
of t (R2Y) and the predictive ability of the models (Q2). VIP plots were generated to recognize metabolites most
signicantly responsible for groups separation. Metabolites with VIP value higher than 1.0 were considered
potential biomarker candidates. To test the accuracy of the multivariate statistical models, and to rule out that
the observed separation in the OPLS-DA is due to chance (p < 0.05), permutation tests were performed with
2000-fold repetition. Statistical signicance of metabolite level dierences was assessed with paired parametric
t-test using Mann–Witney and Bonferroni correction. P values and false discovery rates (FDR; q-value) less than
0.05 were considered statistically signicant. Receiver operating characteristic curve (ROC) analyses together
with random forest modeling were commenced to evaluate the diagnostic value of all selected metabolites. e
performance of the metabolites was estimated using the area under the curve (AUC), 95% condence interval,
specicity and selectivity. Only variables with an AUC value higher than 0.75 were considered to be relevant.
Multivariate statistical analyses were performed independently for the training and validation datasets. Com-
pounds dierentiating between tumor and control serum samples were selected based on external validation,
which uses two independent datasets (here called training and validation dataset) to validate the performance
of a model26. e nal set of potential BC biomarkers selected fullled all criteria in both testing and validation
data sets. Chemometric tools such as 2D PCA, OPLS-DA and ROC analysis were also used to assess metabolic
prole similarities and dierences between dierent grades and stages of bladder cancer. To identify metabolic
pathways impacted by bladder cancer, a metabolic pathway impact analysis was made in MetaboAnalyst 5.0 and
the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway library for Homo sapiens27. Quantitative path-
way enrichment analysis was conducted based on Small Molecule Pathway Database (SMPD). Each impacted
4
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
pathway was classied according to statistical p value, Holm p (p value adjusted by Holm–Bonferroni method)
and FDR (p value adjusted using False Discovery Rate), calculated from pathway topology analysis.
Ethics approval. e study protocol was approved by local Bioethics Committee at the University of
Rzeszow (Poland) (permission no. 2018/04/10).
Results
In this study, we characterized the metabolic proles of one-hundred patients suering from bladder cancer, in
an eort to develop serum-specic metabolic signatures for early and specic detection of bladder cancer. For
this purpose, we recorded ultra-high-resolution LC–MS spectra of 200 total (100 BC and 100 control = NCs)
metabolite extracts from patient and healthy control serum samples in an eort to identify potential discriminant
biomarkers of bladder cancer. Datasets from the BC patients and NCs were divided into two groups, a training
set, comprising 80% of all samples and a validation set, corresponding to 20% of all samples. Patient samples of
a given stage of BC in the training set accounted for 80% of all samples of that stage. Serum metabolic proling
was performed independently on the two datasets. e training set was used to identify serum diagnostic mark-
ers for cancer and stage of its malignancy and, in turn, the validation set was used to independently validate the
diagnostic performance of serum metabolite biomarkers.
Distinguishing between bladder cancer and control serum samples. In total, 5498m/z features
were found in each serum sample in both training and validation set with applied ltration that required that
soware show only features that were in at least nine samples. Unsupervised 2D PCA score plots of both subsets
indicated a good separation between cancer patients and controls based on distinct and characteristic metabolite
proles. e best separation of groups in the training set was obtained along principal components 1 and 2 (i.e.
PC1 and PC2) which accounted for 27.8% and 5.5% respectively. Only a few outliers were detected in the central
95% of the eld of view (Fig.1a). In turn, in the validation set, the best separation between cancer and control
serum samples was also observed along PC1 (28.2%) and PC2 and (6.6%) (Fig.1b).
A supervised multivariate analysis using OPLS-DA analysis was carried out to explore the metabolic dier-
ences between the BC and NC groups. In the training set, the score plot indicated a clear separation between
those two groups (Fig.1c). Two thousand permutation tests were conducted to validate the OPLS-DA model
(Fig.S1 A). Good discrimination was observed between the two groups (Q2 = 0.971, R2Y = 0.992, p value < 5E-04
(0/2000)), revealing substantial dierences in the metabolic proles of cancer versus control serum samples.
Model overview showing high R2Y and Q2 indicating good interpretability and predictability by this OPLS-DA
model (Fig.S1 B). A similar tendency to discriminate BC patients and NCs was observed in OPLS-DA model
of the validation set (Fig.1d), which was conrmed by the very good results of the permutation test (Q2 = 0.929,
R2Y = 0.995, p value < 5E-04 (0/2000)) (Fig.S1C). Potential serum bladder cancer biomarkers were selected on
the basis of the VIP plot resulting from the OPLS-DA model. By combining the VIP (> 1.0) with the results
from the independent t-test (p value and FDR from t-test < 0.05) 1012 variables were selected in training set
as dierential for BC patients and NCs (Table1, Supplementary information 2). In turn, in validation set 1052
variables were considered as signicant (Table2, Supplementary information 2). Finally, 864 common m/z and
rt values were indicated, both in the training and validation sets. Among these features, to 121m/z values were
assigned to a specic chemical compound (Table1). Next, univariate ROC analysis was separately performed
on both training and validation sets to evaluate the diagnostic ability of the models. e results indicated that
in the serum samples all 85 out of previously selected 121 metabolites exhibit very high area under the curve
(AUC) above 0.8. As shown in Fig.1e,f, the combination of mass features in both subsets was found to be a pow-
erful discriminator of control versus bladder cancer serum samples (AUC > 99%). Finally, set of twenty-seven
potential BC biomarkers were selected with cut-o criteria of FC > 2 and < 0.5, Δm/z < 2ppm and mSigma < 50
in both testing and validation data sets. e sensitivity and specicity of the selected 27 metabolites were also
determined and all metabolites disclosed sensitivity and specicity greater than 77 and 85%, respectively (Table1
and S1, Supplementary information 2).
Distinguishing between low‑ and high‑ grade bladder cancer and control serum samples. To
determine whether metabolomics analysis of serum samples could help discriminate between dierent grades
of BC, another series of PCA and OPLS DA analyses were performed on the training (80 NCs, 32 patients with
HG and 45 patients with LG,) and validation (20 NCs, 8 patients with HG and 12 patients with LG,) data sets
(Tabe S1) excluding three samples from patients with PUNLMP. PCA and OPLS-DA scores plots revealed good
discrimination between separately control and cancer groups of varying grades of tumors (LG vs NCs and HG
vs NCs) in both training and validation set (Fig.2, S2). Quality factors for those models amounted to Q2 > 0.89
and R2Y > 0.982, with p values based on permutation tests (n = 2000) smaller than 5E-4 (Fig.S3, S4) indicating a
perfect discrimination of metabolites proles between those groups. However, we did not observe a substantial
dierence between the LG and HG BC patients in the PCA scores plot (data not shown).
In HG BC vs NCs OPLS-DA model 1500 variables were considered as signicant (VIP > 1, p value < 0.05) in
both training and validation set. Among these features, 138m/z values were assigned to a specic chemical com-
pound. Analysis of LG BC vs NCs in OPLS-DA model in training and validation set revealed common 1600m/z
values as signicant contributors to the separation between those two groups of which 148 were assigned to
specic compound. Univariate ROC curve analyses indicated that these models have a good diagnostic perfor-
mance (Fig.2, S2). AUC values for ve out of een metabolites were found to be greater than 0.75. Finally,
set of twenty-three potential LG and HG BC biomarkers were selected with cut-o criteria of FC > 2 and < 0.5,
Δm/z < 2ppm and mSigma < 50 in both testing and validation data sets. e sensitivity and specicity of the
5
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
selected 23 metabolites were also determined and all metabolites disclosed sensitivity and specicity greater than
78% (Table2 and S2, Supplementary information 2).
Distinguishing between dierent stages of bladder cancer and control serum samples. Anal-
ysis of tumor stages was performed for the entire LC–MS dataset of serum metabolite extracts from patients
diagnosed with bladder cancer. Metabolite proling analysis included 69 serum samples from patients with
noninvasive papillary carcinomas (pTa) 19 samples from pT1 stage and 12 from patients with muscle invasive
bladder cancer (pT2).
PCA and OPLS-DA scores plot indicated good separation between NCs and dierent stages of BC (pTa vs
NCs, pT1 vs NCs and pT2 vs NCs, Fig.3). Quality factors for those models were Q2 > 0.904 and R2Y > 0.988, with
p values based on permutation tests (n = 2000) smaller than 5E-4 (Fig. S5) indicating a very good discrimination
of metabolites proles between those groups. Fold Change and VIP plot analysis of the OPLS-DA model indi-
cated 63, 66 and 69m/z values that appeared to be most relevant for sample dierentiation between pTa BC vs
NCs, pT1 BC vs NCs and pT2 BC vs NCs respectively out of pool of features assigned to specic chemical com-
pounds. Next, ROC curve analysis was performed to assess the performance of three models in distinguishing
Figure1. Metabolomic analysis of serum samples from BC and NCs. PCA and OPLS-DA scores plots of
the tumor (violet) and control (orange) serum samples in the training set (a,c) and validation set (b,d). e
receiving operator characteristic (ROC) curves in the training set (e) and validation set (f).
6
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
between pTa; pT1 and pT2 bladder cancer stages and NCs. Finally, set of thirty-seven potential pTa, pT1 and
pT2 BC biomarkers were selected with cut-o criteria of FC > 2 and < 0.5, Δm/z < 2ppm and mSigma < 50 in
both testing and validation data sets (Table3). e sensitivity and specicity of the selected 37 metabolites were
also determined and all metabolites disclosed sensitivity and specicity greater than 74 and 62%, respectively
S3, Supplementary information 2). Comparison of the three groups of cancer stage (pT1 vs. pTa vs. pT2) did not
reveal any statistically signicant dierences (data not shown).
Pathway analysis of potential biomarkers. A metabolic pathway impact analysis was performed using
MetaboAnalyst 5.0 to identify the most relevant pathways involved in the observed changes of serum metabolite
levels. Forty-ve metabolites identied in the UHPLC-UHRMS analysis were subjected to pathway analysis and
quantitative pathway enrichment analysis. Forty-nine compounds were found to be relevant to human metab-
olism. Five metabolic pathways, including linoleic acid metabolism, glycerophospholipid metabolism, alpha-
linolenic acid metabolism, arachidonic acid metabolism and biosynthesis of unsaturated fatty acids were found
to be signicantly impacted comparing BC to controls. Results from pathway impact analysis is shown in Fig.4a
and TableS2 (supplementary information 1).
To expand the metabolomic analysis of pathways related to bladder cancer, we performed a quantitative
enrichment analysis using the MetaboAnalyst 5.0 pathway enrichment module and its associated Small Mol-
ecule Pathway Database (SMPDB). Two additional pathways were found to be relevant to bladder cancer: beta
oxidation of very long chain fatty acids, phospholipid biosynthesis and oxidation of branched chain fatty acids
(Fig.4b and TableS3.
Table 1. Dierential metabolites for discrimination between BC patients and NCs (p value < 0.05; FDR < 0.05;
VIP > 1; FC < 0.5 and > 2). a Experimental monoisotopic mass; bVIP scores derived from OPLS-DA model;
cfold change between cancer and control serum calculated from the abundance mean values for each group—
cancer-to-normal ratio; dROC curve analysis for individual biomarkers; ethe metabolites identied by high
precursor mass accuracy; fthe metabolites identied by matching retention time; gthe metabolites identied by
matching isotopic pattern; hthe metabolites identied by matching MS/MS fragment spectra; AUC: area under
the curve; CI: condence interval; FC: fold change; FDR: false discovery rate; m/z: mass-to-charge ratio; RT:
retention time; Sens.: Sensitivity; Spec.: Specicity; VIP: variable inuence on projection.
No Name Structure m/zaΔm/z [ppm] RT [s] VIPbFCcp value FDR AUC Spec. [%]dSens. [%]d
1Aureonitole,g,h C13H18O2207.1378 − 0.7 173.2 1.82 0.20 5.00E−27 3.20E−25 0.993 96 98
2Norcamphore,g,h C7H10O 111.0803 − 1.0 143.2 1.79 0.29 5.80E−27 3.30E−25 0.992 96 100
3Perillyl alcohole,g C10H16O 153.1273 − 0.8 210.3 1.83 0.25 6.30E−27 3.30E−25 0.992 96 100
4ymole,f,g C10H14O 151.1116 − 0.8 204.2 1.78 0.39 7.30E−27 3.40E−25 0.991 94 99
5 Methyl 2-octynoatee,g,h C9H14O2155.1065 − 1.3 177.7 1.72 0.31 8.40E−27 3.40E−25 0.991 95 98
6 3,5,5-Trimethyl-2-cyclohexen-1-onee,g,h C9H14O 139.1116 − 0.9 193.2 1.83 0.17 9.80E−27 3.50E−25 0.990 96 99
7Alantolactonee,g,h C15H20O2233.1535 − 0.3 194.6 1.80 0.23 9.80E−27 3.50E−25 0.990 94 98
8 4-Heptanonee,f,g C7H14O 115.1116 − 0.9 206.7 1.79 0.24 1.00E−26 3.50E−25 0.990 94 96
97-Epi-Jasmonic acide,g,h C12H18O3211.1328 − 0.2 160.9 1.80 0.19 1.50E−26 4.10E−25 0.988 96 96
10 Dihydrojasmonee,g,h C11H18O 167.1429 − 0.8 228.3 1.78 0.41 1.60E−26 4.20E−25 0.988 94 94
11 Valeric acide,f,g C5H10O2103.0753 − 0.8 132.2 1.75 0.41 2.30E−26 5.10E−25 0.987 91 96
12 4,4,7a-trimethyl-3a,5,6,7-tetrahydro-
3H-indene-1-carboxylic acide,g,h C13H20O2209.1534 − 0.8 197.8 1.75 0.4 5.50E−26 9.20E−25 0.983 94 95
13 1-Acetylindolee,g,h C10H9NO 160.0757 0.1 131.1 1.65 2.13 1.50E−25 2.20E−24 0.978 93 98
14 Linoleic acide,g C18H32O2281.2473 − 0.8 258.6 1.52 2.55 3.50E−25 4.40E−24 0.975 94 94
15 1-Phenyl-1-pentanonee,g,h C11H14O 163.1116 − 0.8 200.5 1.73 0.34 7.50E−25 8.30E−24 0.971 94 86
16 Umbelliferonee,g,h C9H6O3163.0389 − 0.6 182.1 1.69 0.49 1.10E−24 1.10E−23 0.970 91 90
17 Elaidic acide,g C18H34O2283.2629 − 0.9 278.4 1.67 3.33 1.20E−24 1.30E−23 0.969 95 94
18 3-Ethylphenole,g,h C8H10O 123.0803 − 0.9 122.9 1.72 0.36 1.30E−24 1.30E−23 0.969 96 95
19 D-Limonenee,g C10H16 137.1324 − 0.7 143.9 1.72 0.30 2.90E−24 2.60E−23 0.965 91 90
20 6-Hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-
tetrahydrobenzofuran-2(4H)-onee,h C11H16O3197.1171 − 0.8 143.2 1.60 0.41 8.60E−23 6.00E−22 0.950 89 90
21 LysoPE(P-18:0/0:0) e,g,h C23H48NO6P 466.3288 − 1.0 294.2 1.58 0.38 1.30E−22 8.40E−22 0.948 86 91
22 Palmitoleoyl Ethanolamidee,g,h C18H35NO2298.2738 − 0.9 236.5 1.41 2.08 1.50E−22 1.00E−21 0.947 90 91
23 PE(P-16:0e/0:0) e,g,h C21H44NO6P 438.2977 − 0.6 267.5 1.48 0.48 4.70E−20 2.30E−19 0.920 85 88
24 3-Hexanonee,g,h C6H12O 211.1328 − 0.2 160.9 1.40 0.50 5.20E−18 2.10E−17 0.896 86 96
25 Epsilon-caprolactame,f,g,h C6H11NO 114.0914 − 0.2 114.5 1.16 2.35 5.70E−18 2.30E−17 0.896 85 81
26 L-Acetylcarnitinee,f,g C9H17NO4204.1230 − 0.3 22.9 1.37 2.36 1.50E−16 5.40E−16 0.878 85 78
27 LysoPC(18:3)e,g,h C26H48NO7P 518.3236 − 1.0 237.9 1.25 0.48 1.30E−15 4.60E−15 0.866 86 78
7
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
Discussion
Over the past decade, metabolomics studies have provided valuable information on the metabolic prole of
patients suering from various diseases, including cancer, and identied potential markers of developing or
recurring disease. Cancer cells have the ability to reprogram their metabolism in order to support the increased
need for energy caused by rapid proliferation. Monitoring of changes in the levels of various metabolites in
cancer cells or body uids may be a potential source of new cancer biomarkers. To date, many studies have
been published indicating the high potential of metabolomic markers in the diagnosis of various cancers and in
understanding of the mechanisms of cancer initiation and development28.
In this study UHPLC-UHRMS and -UHRMS/MS methods were employed to evaluate changes in serum
metabolite levels between 100 bladder cancer patients and 100 normal controls. e largest class of compounds
dierentiating the NCs group from the BC patients were lipids and lipid-like molecules.Lipids are the fundamen-
tal building blocks of all cell membranes and serve as a long-term energy storage. Furthermore, lipids have many
other important functions within living organisms including transmit nerve impulses, production and regulation
of certain hormones, cushion vital organs, intracellular signal transmission and cell transporting systems. Lipid
metabolism is involved in various processes associated with cancer cells. Over the past decade, numerous stud-
ies have demonstrated that lipids and metabolites associated with lipid metabolism may be potential markers in
human cancers including bladder cancer29. We found that the plasma content of 10 glycerophospholipids includ-
ing PE(P-16:0e/0:0), PC(16:1/16:1), PC(16:0/18:3), LPE(P-18:0/0:0), LPC(14:0/0:0), LPC(P-18:0), LPC(18:3),
LPC(18:2), LPC(20:3), LPC(22:5) were signicantly higher in the serum of NCs than in the BC subjects. is
nding is in line with previous metabolomic studies that demonstrated an association of changes in the levels
of these lipids in the blood with various cancers30. us, alterations in these lipids’ metabolism may, therefore,
play important roles in the development and progression of bladder cancer.
Glycerophospholipids (GPs), also called phospholipids include phosphatidylethanolamines (PE), phosphati-
dylcholines (PC) and phosphatidylethanolamines (PE), all of which are glycerol-based phospholipids. ese com-
pounds are a major component of the membranes of animal cells in which they are asymmetrically distributed
Table 2. Dierential metabolites for discrimination between LG and HG BC patients and NCs (p value < 0.05;
FDR < 0.05; VIP > 1; FC < 0.5 and > 2). a Experimental monoisotopic mass; bVIP scores derived from OPLS-DA
model; cfold change between cancer and control serum calculated from the abundance mean values for each
group—cancer-to-normal ratio; dROC curve analysis for individual biomarkers; ethe metabolites identied
by high precursor mass accuracy; fthe metabolites identied by matching retention time; gthe metabolites
identied by matching isotopic pattern; hthe metabolites identied by matching MS/MS fragment spectra;
AUC: area under the curve; CI: condence interval; FC: fold change; FDR: false discovery rate; HG: high-
grade; LG: low-grade; m/z: mass-to-charge ratio; RT: retention time; Sens.: Sensitivity; Spec.: Specicity; VIP:
variable inuence on projection.
No Metabolites Formula m/zaRT [s]
HG versus control LG versus control
VIPbFCcSpec. [%]dSens. [%]dVIPbFCcSpec. [%]dSens. [%]d
1 Aureonitol e,g,h C13H18O2207.1378 173.22 1.82 0.20 98 97 1.84 0.20 100 96
2 7-Epi-Jasmonic acid e,g,h C12H18O3211.1328 160.86 1.80 0.19 96 97 1.83 0.19 96 96
3 3,5,5-Trimethyl-2-cyclohexen-1-one e,g,h C9H14O 139.1116 193.16 1.86 0.17 95 94 1.87 0.17 98 93
4Alantolactone e,g,h C15H20O2233.1535 194.63 1.80 0.25 95 94 1.84 0.22 98 93
5Valeric acide,f,g C5H10O2103.0753 132.22 1.78 0.41 98 94 1.79 0.41 95 93
6 4-Heptanone e,g,h C7H14O 115.1116 206.71 1.78 0.24 96 97 1.81 0.23 96 93
7 Methyl 2-octynoate e,g,h C9H14O2155.1065 177.72 1.77 0.30 98 91 1.84 0.32 98 98
84,4,7a-trimethyl-3a,5,6,7-tetrahydro-3H-indene-
1-carboxylic acid e,g,h C13H20O2209.1534 197.75 1.74 0.40 98 91 1.75 0.40 96 89
9ymol e,g,h C10H14O 151.1116 204.15 1.74 0.39 99 94 1.76 0.39 99 93
10 Umbelliferone e,g,h C9H6O3163.0389 182.05 – – – 1.74 0.49 94 91
11 4,7-Dimethyl-1,3-benzothiazol-2-ylamine e,g,h C9H10N2S 179.0638 142.04 1.66 2.00 93 88 – – – –
12 D-Limonenee,g C10H16 137.1324 143.88 1.66 0.30 89 94 1.70 0.31 86 93
13 LysoPE(P-18:0/0:0) e,g,h C23H48NO6P 466.3288 294.22 1.63 0.36 91 91 1.55 0.39 86 87
14 1-Acetylindole e,g,h C10H9NO 160.0757 131.14 1.58 2.14 93 94 1.61 2.13 98 93
15 6-Hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahyd-
robenzofuran-2(4H)-onee,h C11H16O3197.1171 143.16 1.57 0.43 94 81 1.64 0.40 91 89
16 PE(P-16:0e/0:0) e,g,h C21H44NO6P 438.2977 267.49 1.56 0.44 88 88 – – – –
17 LysoPC(20:3) e,g,h C28H52NO7P 546.3545 259.45 1.48 0.45 84 81 – – – –
18 Linoleic acide,g C18H32O2281.2473 258.56 1.43 2.64 94 94 1.39 2.44 93 93
19 LysoPC(18:3)e,g,h C26H48NO7P 518.3236 237.91 1.33 0.45 78 78 – – – –
20 L-Acetylcarnitinee,f,g C9H17NO4204.1230 22.91 1.33 2.39 79 84 1.35 2.29 86 80
21 Epsilon-caprolactame,f,g,h C6H11NO 114.0914 114.47 1.19 2.08 89 94 1.32 2.58 89 82
22 3-Hexanonee,g,h C6H12O 101.0960 152.86 – – – – 1.42 0.49 79 93
23 Elaidic acide,g C18H34O2283.2629 278.39 – – – – 1.67 3.36 91 98
8
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
acting as the matrix of dierent membrane proteins. Many previous studies have found low serum PE levels in
various cancers including colon, prostate, lung, and breast cancers indicating these compounds as potential tumor
markers31,32. Serum levels of PE(P-16:0e/0:0) were found by Lin et. al signicantly lower in patients with kidney
cancer compared to controls22. Some studies have provided evidence that translocation of PE from the inner to
the outer leaet of the plasma membrane indicating a loss of asymmetric distribution of aminophospholipids has
been shown as the rst sign of impending apoptosis. us, lower levels of PE(P-16:0e/0:0) in serum may be an
early symptom of apoptotic cell death33. Moreover, human phosphatidylethanolamine-binding protein is associ-
ated with resistance to apoptosis of tumor cells34. It has been reported that exogenous PEs inhibits the growth
and indicates an apoptosis of human hepatoma HepG2 cells35. Lysophosphatidylethanolamine LPC, LysoPC),
LysoPE (P-18:0/0:0) also known as LPE(18:0) was found in lower level in plasma of patients with liver, gastric
colorectal, ovarian and lung cancer compared to the control group32,36,37. Lysophosphatidylcholines (LPC, lysoPC)
Figure2. Metabolomic dierentiation between dierent grades of BC and NCs in training set. PCA (a) and
OPLS-DA (b) scores plots of the control (violet) and low-grade (orange). PCA (c) and OPLS-DA (d) scores plots
of the control (violet) and high-grade (orange). ROC curves for LG (e) and HG (f) BC serum samples vs NCs.
9
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
are an important endogenous signaling phospholipids involved in a variety of important processes, including
cell migration, cell proliferation, inammation and angiogenesis. Decreased LPC plasma level in cancer was
also observed in previous study and was associated with body weight loss and increased inammation. Level
of these compounds is inversely correlated with C-reactive protein levels in plasma (CRP)38. LPCs were found
to be disturbed in several diseases including cancer. Previous metabolomic studies have reported lower level of
PC(34:4), LysoPC(20:3) and LPC(P-18:0) in plasma of patients with ovarian cancer (EOC) compared to control39.
Zhang etal.40 have reported that LPC(14:0) was down-regulated in patients with recurrent EOC. Lower level
of lysophospholipids have been associated with high activity of specic cell-surface G protein-coupled recep-
tors which may cause apoptosis. Tan etal.41 observed signicantly lower of LPC(14:0) in the serum of patients
with colorectal cancer compared with healthy controls. LPC(18:1), LPC(18:2) and LPC(18:3) were signicantly
decreasing in plasma of patients with colorectal cancer compared with healthy controls42,43. Lee etal.32 showed
that the levels of LPC(18:2) were lower in plasma samples of patients with colorectal cancer and higher in plasma
samples of patients with liver, gastric, lung and thyroid compared to those of healthy control individuals using
UHPLC-MS/MS. LPC(18:2) was also found in lower level in plasma of patients with ovarian cancer compared
to the control group36. Previous metabolomic studies have demonstrated that LysoPC(18:1), LysoPC(20:3) were
Figure3. Metabolomic dierentiation between dierent stages of BC and NCs. PCA (a), OPLS-DA (b) scores
plots and ROC curve (c) of the pTa (violet) and control (orange). PCA (d), OPLS-DA (e) scores plots and ROC
curve (f) of the pT1 (violet) and control (orange). PCA (g), OPLS-DA (h) scores plots and ROC curve(i) of the
pT2 (violet) and control (orange).
10
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
down-regulated in patients with ovarian cancer. Four of these compounds including LPC(14:0), LPC(18:3),
LPC(20:3), LPC(22:5) were previously related to kidney injury. Metabolic proling of plasma from patients with
cancer cachexia revealed signicantly lower levels of LPC(14:0), LPC(P-18:0), LPC(18:2), LPC(20:3), LPC(22:5)
and LPE(18:0) compared to healthy controls44. ree of these six LPC including LPC(18:1), LPC(18:3), LPC(22:5)
we identied previously at lower levels in serum of patients with thyroid carcinoma45. To our knowledge, only
one lipid out of the ten most dierentiating both groups cancer and control we indicated has been previously
associated with bladder cancer. Tan etal.18 indicated slightly higher level of LPC(18:2) in serum of patients with
BC compared to controls using UHPLC-Q-ToF MS.
Lower levels of four prenol lipids including perillyl alcohol, D-limonene, thymol, alantolactone were found
in serum of BC compared to controls. ese monoterpenoids commonly occurring in many plants are known
Table 3. Dierential metabolites for discrimination between pTa, pT1 and pT2 BC patients and NCs (p
value < 0.05; FDR < 0.05; VIP > 1; FC < 0.5 and > 2). a Experimental monoisotopic mass; bVIP scores derived
from OPLS-DA model; cfold change between cancer and control serum calculated from the abundance mean
values for each group—cancer-to-normal ratio; dthe metabolites identied by high precursor mass accuracy;
ethe metabolites identied by matching retention time; fthe metabolites identied by matching isotopic pattern;
gthe metabolites identied by matching MS/MS fragment spectra; AUC: area under the curve; FC: fold change;
FDR: false discovery rate; m/z: mass-to-charge ratio; pT1 and pTa—high risk non-muscle invasive bladder
cancer; pT2—muscle invasive bladder cancer; RT: retention time; VIP: variable inuence on projection.
No Metabolites Formula m/zaRT [s]
pTa versus
control pT1 versus
control pT2 versus
control
VIPbFCcVIPbFCcVIPbFCc
1Alpha-hydroxyisobutyric acidd,e C4H8O387.0439 49.21 – – 1.20 2.66 1.05 3.92
2Valeric acidd,e,f C5H10O2103.0753 132.22 1.90 0.41 1.99 0.41 2.05 0.40
3 Creatinined,e,f C4H7N3O 114.0661 21.28 – – – – 1.48 2.02
4 Epsilon-caprolactamd,e,f,g C6H11NO 114.0914 114.47 1.28 2.30 1.51 2.33 1.34 2.46
5 4-Heptanoned,e,f C7H14O 115.1116 206.71 1.96 0.23 1.99 0.25 2.05 0.23
6 3-Ethylphenold,f,g C8H10O 123.0803 122.87 1.88 0.36 1.94 0.35 1.95 0.35
7 D-Limonened,f C10H16 137.1324 143.88 1.86 0.30 1.74 0.33 1.87 0.28
8 3,5,5-Trimethyl-2-cyclohexen-1-oned,f,g C9H14O 139.1116 193.16 2.00 0.17 2.11 0.17 2.17 0.17
9ymold,e,f C10H14O 151.1116 204.15 1.91 0.39 1.82 0.41 1.84 0.40
10 Perillyl alcohold,f C10H16O 153.1273 210.29 2.03 0.25 2.20 0.26 2.31 0.24
11 Methyl 2-octynoated,f,g C9H14O2155.1065 177.72 1.89 0.31 1.99 0.32 2.23 0.29
12 1-Acetylindoled,f,g C10H9NO 160.0757 131.14 1.78 2.09 1.75 2.19 1.70 2.08
13 Umbelliferoned,f,g C9H6O3163.0389 182.05 1.84 0.49 2.06 0.46
14 1-Phenyl-1-pentanoned,f,g C11H14O 163.1116 200.50 1.94 0.33 2.04 0.36 2.04 0.37
15 4,7-Dimethyl-1,3-benzothiazol-2-ylamined,f,g C9H10N2S 179.0638 142.04 – – 1.82 2.02 – –
16 Benzophenoned,f,g C13H10O 183.0809 226.43 1.56 2.00 1.45 2.14 – –
17 L-Acetylcarnitined,e,f C9H17NO4204.1230 22.91 1.46 2.15 1.48 2.37 1.53 2.81
18 Aureonitold,f,g C13H18O2207.1378 173.22 1.97 0.20 2.00 0.22 2.11 0.20
19 4,4,7a-trimethyl-3a,5,6,7-tetrahydro-3H-indene-1-carboxylic acidd,f,g C13H20O2209.1534 197.75 1.89 0.40 1.87 0.42 1.99 0.38
20 7-Epi-Jasmonic acidd,f,g C12H18O3211.1328 160.86 1.97 0.19 2.03 0.20 1.99 0.21
21 Cys-Prod,f,g C8H14N2O3S 219.0797 91.87 1.03 2.34 – – – –
22 Pro-Leud,f,g C11H20N2O3229.1546 46.53 – – – – 1.14 2.35
23 Alantolactoned,f,g C15H20O2233.1535 194.63 1.95 0.23 1.99 0.25 1.94 0.27
24 Curcumold,f,g C15H24O2237.1848 226.69 1.12 0.23
25 Isovalerylcarnitined,e,f C12H23NO4246.1697 121.55 1.16 2.18 1.11 2.49 1.07 2.45
26 Linoleic acidd,f C18H32O2281.2473 258.56 1.59 2.35 1.53 2.62 1.49 2.73
27 Elaidic acidd,f C18H34O2283.2629 278.39 1.87 3.35 2.02 3.86 1.73 2.91
28 PE(P-16:0e/0:0)d,f,g C21H44NO6P 438.2977 267.49 1.59 0.49 1.95 0.39 2.08 0.36
29 Cefazolind,f,g C14H14N8O4S3455.0371 135.59 – – 1.02 288.76 1.30 62.93
30 LysoPE(P-18:0/0:0)d,f,g C23H48NO6P 466.3288 294.22 1.72 0.39 1.90 0.34 2.16 0.28
31 LysoPC(14:0/0:0)d,f,g C22H46NO7P 468.3080 236.23 – – – – 1.96 0.33
32 LysoPC(P-18:0)d,g C26H54NO6P 508.3756 294.32 – – – – 1.60 0.48
33 LysoPC(18:2)d,f,g C26H50NO7P 520.3393 246.39 – – – – 1.80 0.44
34 LysoPC(20:3)d,f,g C28H52NO7P 546.3545 259.45 – – 1.57 0.45 1.76 0.39
35 LysoPC(22:5)d,f,g C30H52NO7P 570.3546 255.47 – – – – 1.48 0.45
36 PC(16:1/16:1)d,g C40H76NO8P 730.5380 312.51 – – 1.61 0.15 – –
37 PC(16:0/18:3)d,g C42H78NO8P 756.5535 313.85 – – 1.19 0.42 – –
11
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
for their anti-tumor, antioxidant, anti-inammatory and anti-fungal activity. ymol and limonene have been
shown to inhibit bladder cancer cell proliferation and induces these cells apoptosis46,47.
We found that serum levels of metabolites: L-acetylcarnitine, linoleic acid and elaidic acid were higher and
three others: valeric acid and 7-epi-jasmonic acid lower in BC patients compared to NCs. e levels of linoleic
and elaidic acid were also found as signicantly higher inpatients withcolorectal cancer48. Increased serum
activity of acetylcarnitine have been previously pointed out as a potential tumor biomarkers49,50. Acetylcarnitine
is a naturally occurring acetic acid ester of carnitine, important in mitochondrial tricarboxylic acid (TCA) cycle
activity. Increased urine levels of this compound have previously been reported in patients with BC51. Eleva-
tion of acetylcarnitine may be an indication of decreased carbon ow into the TCA cycle or excess production
of acetyl-CoA52. Previous studies revealed elevated urine level of acetylcarnitine and isovalerylcarnitine in BC
patients compared to controls53,54. However, the association between isovalerylcarnitine and bladder cancer has
not yet been explained.
In order to apply the correct treatment regimens for BC patients, in addition to indicating the neoplasm,
it is necessary to precisely and accurately indicate the stage and grade of this cancer. In total, 23 dierential
metabolites were identied as potential marker for discriminating between LG and HG BC patients and NCs.
Among these metabolites, 18 metabolites were the common characteristic of both LG and HG BC patients. ree
metabolites including lysoPC(20:3), PE(P-16:0e/0:0) and 2(4H)-benzofuranone, 6-Hydroxy-4,4,7a-trimethyl-
5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one were identied in much higher level only in the serum of patients
with HG BC, while four metabolites including 3-hexanone, diethylene glycol 2-ethylhexyl ether, elaidic acid,
umbelliferone were found in signicant higher level only in the serum of patients with LG BC patients.
In total, 38 dierential metabolites were identied as potential marker for discriminating between pTa, pT1
and pT2 BC patients and NCs. Among these metabolites, 22 metabolites were the common to all three stages of
BC. Two metabolites including Cys-Pro and curcumol were identied in much higher levels only in the serum
of patients with pTa BC, while two metabolites including LysoPC(20:3) and alpha-hydroxyisobutyric acid were
found in signicant higher level only in the serum of patients with pT1 BC patients. Moreover, ve metabolites
including norcamphor, creatinine, dihydrojasmone, pro-leu, palmitoleoyl ethanolamide were found in signicant
higher level only in the serum of patients with pT2 BC patients.
We demonstrate that ultra-high-resolution mass spectrometry is a powerful tool for the characterization of
the serum metabolome dierences in BC. Twenty-seven potentially robust metabolic biomarkers were identied
for 100 tumor serum samples from patients with BC patients aer comparison against 100 healthy controls owing
to the excellent predictive ability of AUC > 0.99. We also identied twenty-three metabolites that might be used
as potential biomarkers to distinguish LG and HG and thirty-seven metabolites that may serve to dierentiate
between the pTa/pT1 and pT2 stages of BC. Our results suggest that dierential serum metabolite proles and
can help identify patients with BC compared with NCs, with signicant discriminating power between dierent
stages and grades of bladder cancer. Our ndings, may potentially provide facile and less invasive diagnostic
methodology for detection of dierent stages and grades of bladder cancer and recurrent disease management. In
the future, a new class of biomarkers of BC could contribute to development of non-invasive, highly specic and
sensitive diagnostic tests that could be employed to aid the detection of new tumors and also predict recurrences.
Figure4. Results of pathway topology analysis of selected statistically signicant metabolites in BC. A Pathway
analysis based on KEGG(a); bubble area donating to the impact of each pathway with color representing the
signicance from highest in red to lowest in white; (b) Quantitative enrichment analysis based on SMPDB.
12
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
Data availability
e data that support the ndings of this study is available from the corresponding author upon reasonable
request.
Received: 12 June 2022; Accepted: 31 August 2022
References
1. Sung, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185
Countries. CA. Cancer J. Clin. 71, 209–249 (2021).
2. Robins, D. J. et al. Mp86-17 the 2017 American joint committee on cancer eighth edition cancer staging manual: changes in staging
guidelines for cancers of the kidney, renal pelvis and ureter, bladder, and urethra. J. Urol. 197, e1163 (2017).
3. Troisi, J. et al. A serum metabolomic signature for the detection and grading of bladder cancer. Appl. Sci. 11, 2835 (2021).
4. Lee, H. H. & Ham, W. S. Perioperative immunotherapy in muscle-invasive bladder cancer. Transl. Cancer Res. 9, 6546–6553 (2020).
5. Yang, Q. et al. Metabolomics biotechnology, applications, and future trends: a systematic review. RSC Adv. 9, 37245–37257 (2019).
6. Raja, G., Jung, Y., Jung, S. H. & Kim, T. J. 1H-NMR-based metabolomics for cancer targeting and metabolic engineering—a review.
Process Biochem. 99, 112–122 (2020).
7. Liu, X. et al. LC-MS-based plasma metabolomics and lipidomics analyses for dierential diagnosis of bladder cancer and renal
cell carcinoma. Front. Oncol. 10, 717 (2020).
8. Pan, Z. & Raery, D. Comparing and combining NMR spectroscopy and mass spectrometry in metabolomics. Anal. Bioanal.
Chem. 387, 525–527 (2007).
9. Ng, K., Stenzl, A., Sharma, A. & Vasdev, N. Urinary biomarkers in bladder cancer: A review of the current landscape and future
directions. Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. 39, 41–51 (2021).
10. Batista, R. et al. Biomarkers for bladder cancer diagnosis and surveillance: A comprehensive review. Diagnostics 10, 39 (2020).
11. Walsh, M. C., Brennan, L., Malthouse, P. G., Roche, H. M. & Gibney, M. J. Eect of acute dietary standardization on the urinary,
plasma, and salivary metabolomic proles of healthy humans 13. Am. J. Clin. Nutr. 84, 531–539 (2006).
12. Gupta, A. et al. NMR-derived targeted serum metabolic biomarkers appraisal of bladder cancer: A pre- and post-operative evalu-
ation. J. Pharm. Biomed. Anal. 183, 113134 (2020).
13. Bansal, N. et al. Low- and high-grade bladder cancer determination via human serum-based metabolomics approach. J. Proteome
Res. 12, 5839–5850 (2013).
14. Cao, M., Zhao, L., Chen, H., Xue, W. & Lin, D. NMR-based metabolomic analysis of human bladder cancer. Anal. Sci. 28, 451–456
(2012).
15. Amara, C. S. et al. Serum metabolic proling identied a distinct metabolic signature in bladder cancer smokers: A key metabolic
enzyme associated with patient survival. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 28, 770–781 (2019).
16. Vantaku, V. et al. Large-scale proling of serum metabolites in African American and European American patients with bladder
cancer reveals metabolic pathways associated with patient survival. Cancer 125, 921–932 (2019).
17. Sahu, D., Lotan, Y., Wittmann, B., Neri, B. & Hansel, D. E. Metabolomics analysis reveals distinct proles of nonmuscle-invasive
and muscle-invasive bladder cancer. Cancer Med. 6, 2106–2120 (2017).
18. Tan, G. et al. ree serum metabolite signatures for diagnosing low-grade and high-grade bladder cancer. Sci. Rep. 7, 1–11 (2017).
19. Lin, L. et al. LC-MS based serum metabonomic analysis for renal cell carcinoma diagnosis, staging, and biomarker discovery. J.
Proteome Res. 10, 1396–1405 (2011).
20. Zhou, Y. et al. e development of plasma pseudotargeted GC-MS metabolic proling and its application in bladder cancer. Anal.
Bioanal. Chem. 408, 6741–6749 (2016).
21. Lepara, Z. et al. Serum malondialdehyde (MDA) level as a potential biomarker of cancer progression for patients with bladder
cancer. Rom. J. Intern. Med. 58, 146–152 (2020).
22. Lin, L. et al. LC-MS-based serum metabolic proling for genitourinary cancer classication and cancer type-specic biomarker
discovery. Proteomics 12, 2238–2246 (2012).
23. MassBank of North America. Available at: https:// mona. ehn lab. ucdav is. edu/. Accessed: 8th June 2022
24. Mass Spectrometry Data Center, NIST. ass Spectral Library Available at: https:// chemd ata. nist. gov/. Accessed 1st April 2022.
25. Pang, Z. et al. MetaboAnalyst 50: Narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Res. 49, W388–
W396 (2021).
26. Ho, S. Y., Phua, K., Wong, L. & Bin Goh, W. W. Extensions of the external validation for checking learned model interpretability
and generalizability. Patterns 1, 100129 (2020).
27. Okuda, S. et al. KEGG Atlas mapping for global analysis of metabolic pathways. Nucleic Acids Res. 36, W423–W426 (2008).
28. Han, J., Li, Q., Chen, Y. & Yang, Y. Recent metabolomics analysis in tumor metabolism reprogramming. Front. Mol. Biosci. 8,
763902 (2021).
29. Besiroglu, H. Lipid metabolism proling and bladder cancer. Metabolomics Open Access 5, 1–4 (2015).
30. Wolrab, D., Jirásko, R., Chocholoušková, M., Peterka, O. & Holčapek, M. Oncolipidomics: Mass spectrometric quantitation of
lipids in cancer research. TrAC Trends Anal. Chem. 120, 10 (2019).
31. Lu, Y. et al. Comparison of hepatic and serum lipid signatures in hepatocellular carcinoma patients leads to the discovery of
diagnostic and prognostic biomarkers. Oncotarget 9, 5032 (2018).
32. Lee, G. B., Lee, J. C. & Moon, H. Plasma lipid prole comparison of ve dierent cancers by nanoow ultrahigh performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta https:// doi. org/ 10. 1016/j. aca. 2019. 02. 021 (2019).
33. Wang, X. et al. A novel human phosphatidylethanolamine-binding protein resists tumor necrosis factor α-induced apoptosis by
inhibiting mitogen-activated protein kinase pathway activation and phosphatidylethanolamine externalization*. J. Biol. Chem.
279, 45855–45864 (2004).
34. Wang, X. et al. Silencing of human phosphatidylethanolamine-binding protein 4 sensitizes breast cancer cells to tumor necrosis
factor-alpha-induced apoptosis and cell growth arrest. Clin. Cancer Res. 11, 7545–7553 (2005).
35. Yao, Y. et al. Exogenous phosphatidylethanolamine induces apoptosis of human hepatoma HepG2 cells via the bcl-2/bax pathway.
World J. Gastroenterol. 15, 1751 (2009).
36. Yagi, T. et al. Challenges and inconsistencies in using lysophosphatidic acid as a biomarker for ovarian cancer. Cancers 11, 520
(2019).
37. Ravipati, S., Baldwin, D. R., Barr, H. L., Fogarty, A. W. & Barrett, D. A. Plasma lipid biomarker signatures in squamous carcinoma
and adenocarcinoma lung cancer patients. Metabolomics 11, 1600–1611 (2015).
38. Taylor, L. A., Arends, J., Hodina, A. K., Unger, C. & Massing, U. Plasma lyso-phosphatidylcholine concentration is decreased in
cancer patients with weight loss and activated inammatory status. Lipids Health Dis. 6, 1–8 (2007).
39. Li, J. et al. Distinct plasma lipids proles of recurrent ovarian cancer by liquid chromatography-mass spectrometry. Oncotarget 8,
46834 (2017).
13
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2022) 12:15156 | https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9
www.nature.com/scientificreports/
40. Zhang, F. et al. e predictive and prognostic values of serum amino acid levels for clear cell renal cell carcinoma. Urol. Oncol.
Semin. Orig. Investig. 35, 392–400 (2017).
41. Tan, B. et al. Metabonomics identies serum metabolite markers of colorectal cancer. J. Proteome Res. https:// doi. org/ 10. 1021/
pr400 337b (2013).
42. Shen, S. et al. A plasma lipidomics strategy reveals perturbed lipid metabolic pathways and potential lipid biomarkers of human
colorectal cancer. J. Chromatogr. B 1068–1069, 41–48 (2017).
43. Zhao, Z. et al. Plasma lysophosphatidylcholine levels: potential biomarkers for colorectal cancer. J Clin Oncol 25, 2696–2701 (2007).
44. Cala, M. P. et al. Multiplatform plasma ngerprinting in cancer cachexia: a pilot observational and translational study. J. Cachexia.
Sarcopenia Muscle 9, 348–357 (2018).
45. Yao, Z. et al. Serum metabolic proling and features of papillary thyroid carcinoma and nodular goiter. Mol. Biosyst. 7, 2608–2614
(2011).
46. Li, Y. et al.ymol inhibits bladder cancer cell proliferation via inducing cell cycle arrest and apoptosis. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 491, 530–536 (2017).
47. Ye, Z., Liang, Z., Mi, Q. & Guo, Y. Limonene terpenoid obstructs human bladder cancer cell (T24 cell line) growth by inducing
cellular apoptosis, caspase activation, G2/M phase cell cycle arrest and stops cancer metastasis. JBUON 25, 280–285 (2020).
48. Wang, X., Wang, J., Rao, B. & Deng, L. I. Gut ora proling and fecal metabolite composition of colorectal cancer patients and
healthy individuals. Exp. er. Med. 13, 2848–2854 (2017).
49. Nizioł, J. et al. Metabolomic study of human tissue and urine in clear cell renal carcinoma by LC-HRMS and PLS-DA. Anal. Bio-
anal. Chem. 410, 3859–3869 (2018).
50. Ganti, S. et al. Urinary acylcarnitines are altered in human kidney cancer. Int. J. Cancer 130, 2791–2800 (2012).
51. Wittmann, B. M. et al. Bladder cancer biomarker discovery using global metabolomic proling of urine. PLoS ONE 9, e115870
(2014).
52. Schroeder, M. A. et al. e cycling of acetyl-coenzyme A through acetylcarnitine buers cardiac substrate supply: A hyperpolarized
13C magnetic resonance study. Circ. Cardiovasc. Imaging 5, 201–209 (2012).
53. Jin, X. et al. Diagnosis of bladder cancer and prediction of survival by urinary metabolomics. Oncotarget 5, 1635–1645 (2014).
54. Rodrigues, D. et al. Biomarkers in bladder cancer: A metabolomic approach using invitro and exvivo model systems. Int. J. Cancer
139, 256–268 (2016).
Acknowledgements
Research was supported mainly by National Science Centre (Poland), research project SONATA Number
UMO-2018/31/D/ST4/00109.
Author contributions
J.N.: Conceptualization, Methodology, Formal analysis, Investigation, Resources, Data Curation, Writing—Origi-
nal dra, Writing—Review & Editing, Visualization, Supervision, Project administration, Funding acquisition,
K.O: Investigation, Resources; Writing—Original dra; A.P.: Investigation; Data Curation; A.K.: Investigation,
Data Curation; A.O.: Resources; T.O.: Resources; T.R.: Methodology, Resources, Data Curation, Writing—Review
& Editing, Supervision.
Competing interests
e authors declare no competing interests.
Additional information
Supplementary Information e online version contains supplementary material available at https:// doi. org/
10. 1038/ s41598- 022- 19576-9.
Correspondence and requests for materials should be addressed to J.N.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and
institutional aliations.
Open Access is article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International
License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or
format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the
Creative Commons licence, and indicate if changes were made. e images or other third party material in this
article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the
material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not
permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from
the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creat iveco mmons. org/ licen ses/ by/4. 0/.
© e Author(s) 2022
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
Available online 22 May 2023
0731-7085/© 2023 Elsevier B.V. All rights reserved.
Targeted and untargeted urinary metabolic proling of bladder cancer
Krzysztof Ossoli´
nski
a
, Tomasz Ruman
b
, Valerie Copie
c
, Brian P. Tripet
c
, Artur Kołodziej
d
,
Aneta Płaza-Altamer
d
, Anna Ossoli´
nska
a
, Tadeusz Ossoli´
nski
a
, Anna Nieczaj
b
, Joanna Nizioł
b
,
*
a
Department of Urology, John Paul II Hospital, Grunwaldzka 4 St., 36-100 Kolbuszowa, Poland
b
Rzesz´
ow University of Technology, Faculty of Chemistry, 6 Powsta´
nc´
ow Warszawy Ave., 35-959 Rzesz´
ow, Poland
c
The Department of Chemistry and Biochemistry, Montana State University, Bozeman, MT 59717, United States
d
Doctoral School of Engineering and Technical Sciences at the Rzesz´
ow University of Technology, 8 Powsta´
nc´
ow Warszawy Ave., 35-959 Rzesz´
ow, Poland
ARTICLE INFO
Keywords:
Bladder cancer
Biomarker
Human urine
Metabolomics
NMR
Laser mass. spectrometry
ABSTRACT
Bladder cancer (BC) is frequent cancer affecting the urinary tract and is one of the most prevalent malignancies
worldwide. No biomarkers that can be used for effective monitoring of therapeutic interventions for this cancer
have been identied to date. This study investigated polar metabolite proles in urine samples from 100 BC
patients and 100 normal controls (NCs) using nuclear magnetic resonance (NMR) and two methods of high-
resolution nanoparticle-based laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS). Five urine metabolites
were identied and quantied using NMR spectroscopy to be potential indicators of bladder cancer. Twenty-ve
LDI-MS-detected compounds, predominantly peptides and lipids, distinguished urine samples from BC and NCs
individuals. Level changes of three characteristic urine metabolites enabled BC tumor grades to be distinguished,
and ten metabolites were reported to correlate with tumor stages. Receiver-Operating Characteristics analysis
showed high predictive power for all three types of metabolomics data, with the area under the curve (AUC)
values greater than 0.87. These ndings suggest that metabolite markers identied in this study may be useful for
the non-invasive detection and monitoring of bladder cancer stages and grades.
1. Introduction
Over the past decades, cancer mortality has been increasing. Ac-
cording to GLOBOCAN 2020, the number of new cancer cases diagnosed
in 2020 will be 19.3 million, with over 10.0 million dying as a result of
cancer [1]. Bladder cancer (BC) remains one of the most common types
of cancer worldwide, and the most common malignancy of the urinary
tract [1]. The scale of the problem is so high that, in 2020, nearly 200,
000 people died of bladder cancer and three times more suffered from
the disease [1]. This type of cancer is also more common in men. To
date, data indicate that BC in females are 70% less frequent than in
males, and among male and female BC patients, the mortality rate is
reduced by one-third in females compared to males [2]. The increasing
incidence and high mortality rate due to bladder cancer is a signicant
burden on health systems worldwide [3].
Another challenge is the high frequency of disease recurrence and
recurrent progression following transurethral resection. This challenge
is compounded by the high costs of cystoscopy examinations which are
needed for early detection and to monitor BC patients following cancer
treatment. Moreover, early detection of the disease depends signi-
cantly on the knowledge and experience of the pathologist, especially in
the case of early stages of BC, which may not be readily apparent in
cystoscopic examination [4]. Early detection has another advantage, as
it reduces health care costs compared to the costs of treating BC patients
in the advanced stages of the disease.
Currently, the primary methods to detect BC include urine cytology,
cystoscopy, biopsy, and computed tomography, all displaying low
sensitivity for cancer detection. Based on worldwide reports, the most
common symptoms of BC involve hematuria, pain and burning, painful
frequent urination, feeling of an incompletely empty bladder. Cystos-
copy is the most common detection method for patients suffering from
these conditions. Given the invasive character of these procedures, there
exists a strong need for less aggressive and more quantitative approaches
to detect, diagnose, and monitor disease progression of bladder cancer
[5].
Fortunately, research activities aimed at identifying new biomarkers
of BC have increased recently [6]. The Food and Drugs Administration
has approved a few biomarker kits for disease detection so far, which
* Corresponding author.
E-mail address: jniziol@prz.edu.pl (J. Nizioł).
Contents lists available at ScienceDirect
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
journal homepage: www.journals.elsevier.com/journal-of-pharmaceutical-and-biomedical-analysis
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2023.115473
Received 24 April 2023; Received in revised form 18 May 2023; Accepted 20 May 2023
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
2
consist mainly of protein detection [7]. Regrettably, due to the high
costs of identifying these markers in new patients and the relatively low
predictable power for BC, none of these approved kits have been
employed for general use, despite the fact that some of them are used to
monitor the recurrence of bladder cancer, including the UroVysion
bladder cancer kit. The problem is compounded by the fact that many of
procedures needed to identify these protein markers are cumbersome
and difcult to use in the clinic [8]. In addition, identication and
quantication of these recently approved BC protein markers require
sophisticated instrumentation which is not readily available to most
clinicians. Due to growing knowledge in the eld of oncology, many
studies have focused on biomarker discovery to facilitate the diagnosis,
screening, and follow-up of communities susceptible to bladder cancer
[4].
Metabolomics is part of the eld of systems biology, which aims to
characterize metabolic changes at a global level, and to inform on
metabolome changes, i.e., small molecule proles, of complex organ-
isms underlying their cellular phenotypes [9]. Metabolomics studies on
human subjects focus primarily of metabolites measured in body uids
or extracted from cells or tissues. The development and progression of
many types of cancer is reected in changes of the metabolomes
analyzed from human biospecimens, including urine and serum [10]. In
cases of BC, the most useful analyses may be from the analysis of urine.
Although urine metabolomics may be inuenced by dilution, it is more
readily available and non-invasive than serum or tissue analysis. [11]. In
recent years, numerous comprehensive reviews have been published
that provide detailed information on the various metabolomics ap-
proaches utilized for the detection and identication of biomarkers in
bladder cancer [12–15]. However, none of the identied biomarkers to
date can ensure 100% detection of cancer at an early stage, and their
high detection characteristics come with a substantial cost that global
health services cannot afford. Nonetheless, scientists should continue
researching new biomarkers to increase the proportion of early bladder
cancer detection cases.
Most metabolomics studies of BC patient urine samples have used
non-targeted approaches including gas chromatography (GC)- or liquid
chromatography (LC)- coupled MS [16–19]. Only few of these studies
have used NMR [20,21] approaches.
In 2010, one of the initial reports on metabolomic proling of urine
from patients with BC using NMR was published [20]. The research
included samples from 33 non-muscle invasive BC patients, 31 in-
dividuals with benign conditions such as urinary tract infection, 2 with
bladder stones, and 37 healthy individuals. The study identied ve
metabolites including citrate, dimethylamine, phenylalanine, taurine
and hippurate that specically reected biochemical changes in cancer
cell metabolism. The ndings suggested that NMR-based urine analysis
had the potential to serve as a non-invasive early detection test for a
range of pathological conditions, including BC. Another NMR-based
study was published in 2019 that focused on urine and tissue
proling. [21]. The study analyzed urine samples collected from 35
patients before and after transurethral resection. The results showed a
correlation between taurine and other amino acid metabolic pathways
perturbed in bladder cancer tissue samples and those observed in the
urine samples.
There are many publications in the literature regarding the untar-
geted analysis of urine extracts using mass spectrometry to identify
potential small-molecule biomarkers for early detection of BC [16,
22–24]. However, to date, only two papers have been published that
include a large group of more than one-hundred patients and have un-
dergone external validation [18,25]. Additionally, there is a limited
number of reports on the analysis of urine from patients with BC, taking
into account the division into different stages and grades of cancer, as
well as gender and age [26,27].
To the best of our knowledge, there are currently no published
metabolomics studies that have employed both NMR and laser desorp-
tion/ionization mass spectrometry (LDI-MS) to analyze the metabolite
proles of urine samples of BC patients. NMR provides information
about the molecular structure of metabolites and can identify a wide
range of metabolites with high accuracy and reproducibility with easy
and reliable quantication. On the other hand, LDI-MS provides com-
plementary information to NMR as it is much more sensitive and can
detect a wider range of metabolites. In addition, the use of silver
nanoparticles (AgNPs) in laser desorption/ionization mass spectrometry
(LDI-MS) has been reported to enhance the detection of lipids. AgNPs
can interact with the lipid molecules in the sample, increasing their
ionization efciency and sensitivity. By combining these two tech-
niques, the study can obtain a more comprehensive view of the metab-
olite prole of BC patients’ urine samples. This can provide a more
accurate and detailed understanding of the metabolic changes associ-
ated with BC, which can lead to the development of more specic and
sensitive biomarkers for early detection, diagnosis, and treatment of BC
[28,29].
Herein, we report results from targeted and non-targeted metab-
olomics analyses of 199 urine samples acquired from 99 patients diag-
nosed with BC and 100 healthy controls. This study successfully
identied specic alterations in the urine metabolomes of BC patients
compared to those of control individuals. In addition, metabolite prole
changes were found to be informative reporters of the stage and grade of
bladder cancer. This study was conducted using high-resolution
1
H NMR
and two laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) tech-
niques, and resulting data were validated using both multivariate and
univariate statistical analyses.
2. Materials and methods
2.1. Materials and equipment
All solvents were of high quality ‘LC-MS’ grade and purchased from
Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Deuterium oxide (D
2
O) and DSS
(4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) were purchased from
Sigma Inc. (Boston, MA, USA).
2.2. Collection of human urine samples
Urine samples were collected from BC patients and normal controls
at Kolbuszowa’s John Paul II Hospital (Poland). NMR and MS metabolite
prole datasets collected on cancer and control urine samples were each
randomly divided into two groups for analysis. The two groups consisted
of a training set which included 70% of the data (either NMR or MS), and
a validation set which included the remaining 30% of the data.
Following detailed clinical questioning and laboratory testing, all pa-
tients underwent transurethral resection of bladder tumor (TURBT). The
study was approved by the local Bioethics Committee (permission no.
2018/04/10). A little more than half of the patients (n =54) displayed
low-grade bladder cancer and papillary urothelial neoplasm of low
malignant potential (PUNLMP) (n =3), while the remaining patients (n
=41) had high-grade disease. Both high- and low-grade neoplasms were
found in two cases. Most of these patients (n =69) had noninvasive
papillary carcinomas (pathologic stage Ta, pTa), 19 had submucosal
invasive tumors (pathologic stage T1, pT1), and 12 had muscle invasive
bladder cancer (pathologic stage T2, pT2). The average age of diagnosed
BC patients was 74 ±10 years, while the average age of NCs was 64 ±
12. Each participant provided 10 ml of urine which was stored at −60
o
C
until further use. The sample collection period extended from October
2020 to November 2021. Subsequently, in December 2021, NMR and
MS measurements were performed on the collected urine samples.
Table 1 and table S1 in supplementary data provides an overview of the
clinical characteristics of the patients included in the study.
2.3. Analysis of tissue samples
Urine extracts were analyzed using high-resolution
1
H NMR and gold
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
3
and silver-109 nanoparticle-based laser desorption/ionization mass
spectrometry (AuNPs- and
109
AgNPs-LDI-MS). Gold and silver-109
nanoparticles (AuNPs and
109
AgNPs) were generated with pulsed ber
laser (PFL) 2D galvoscanner (2D GS) laser synthesis in solution/sus-
pension (LASiS) as described in our previous publication [30]. Supple-
mentary data detail the acquisition and processing of NMR and MS
spectra (S1-S4).
2.4. Preparation of urine metabolite extracts for
1
H NMR metabolomics
As stated in our recent publication (and detailed in the Supplemen-
tary data), metabolites whose polarity ranged from medium-to-high
were analyzed from urine samples (Supplementary data, section S1)
[31–33].
2.5. Preparation of urine samples for LDI-MS studies
Thawed urine samples were diluted in methanol 500 times (v/v).
After that, 0.3 µl volumes were directly placed on target plates:
109
Ag
and Au PFL-2D GS LASiS [30]. Following solvent evaporation in air, the
Autoex Speed apparatus was used to measure the plates containing the
samples.
2.6. Data processing and spectral acquisition
A comprehensive explanation of the acquisition and processing of
NMR and MS spectra can be found in the supplementary material, spe-
cically in sections S2 to S4.
2.7. Multivariate statistical analysis
MetaboAnalyst version 5.0 online software was used to analyze all
metabolite datasets [34]. The statistical multivariate analysis used here
is similar to the one described in our recent publications [27,32,35].
Briey the metabolite data obtained from each analytical technique was
log-transformed and auto-scaled. The resulting metabolite proles were
then subjected to unsupervised Principal Component Analysis (PCA) and
Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA). To
identify metabolites that differentiated between the groups, we utilized
a comprehensive approach. Specically, we applied (i) variable impor-
tance in projection (VIP) from OPLS-DA model (VIP >1.0), (ii)
two-sample t-tests & Wilcoxon Rank-Sum Tests with Mann-Whitney and
Bonferroni correction (FDR <0.05, p-values <0.05), (iii) fold change
(FC) analysis (FC >2.0 or <0.5), and (iv) area under the curve (AUC)
receiver operating characteristics (ROC) analysis with random forest
modeling (AUC >0.7). Subsequently, we validated the potential bio-
markers meeting these criteria in an independent cohort (validation set)
to conrm their reproducibility. In the validation set, we used the same
statistical criteria as in the training set to test for signicance. Impor-
tantly, the potential biomarkers that were signicant in the training set
were also signicant in the validation set, conrming their reproduc-
ibility. To test the robustness and avoid overtting of the OPLS-DA
model we performed random permutation analysis with 2000 repeats
and 7-fold cross-validation. The overall performance of the OPLS-DA
model was assessed by evaluating the goodness of ft (R
2
Y) and the
predictive ability of the model (Q
2
). A metabolic pathway impact
analysis was performed using MetaboAnalyst version 5.0 [34] and the
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [36] to identify metabolic
pathways that are in all likelihood impacted by bladder cancer. One-way
analysis of variance (ANOVA) was used to compare differences between
different stages and grades of BC, with Tukey’s post-hoc testing used if
the ANOVA revealed signicant differences. MS and NMR data were
analyzed using the same statistical method.
3. Results
In this work, the urine metabolite proles of BC patients were
examined to identify urine-specic metabolic indicators of BC. The
study involved 100 patients diagnosed with BC and 100 patients in
whom urinary tract cancers were excluded. However, data from 99 urine
samples from BC patients were used for the statistical analysis of the
NMR results. For one sample, readable NMR spectra could not be ob-
tained. With the much more sensitive laser desorption/ionization mass
spectrometry (LDI-MS), this was no longer a problem and data from all
100 BC samples were included in the statistical analysis. In this case 400
of LDI-MS spectra were collected using
109
Ag and Au PFL-2D GS LASiS
targets.
3.1. Differentiation between BC and control urine based on
1
H NMR data
Urine metabolites from patients with BC (99 samples) and controls
(100 samples) were analyzed using high-resolution 1D
1
H NMR. Alto-
gether, 39 metabolites were identied and quantied in each urine
sample following published protocols [31]. Fig. 1 depicts an overlay of
Table 1
Participant characteristics.
BC Control
Training Validation Training Validation
Number
General 69 30 70 30
Male 54 26 46 24
Female 15 4 24 6
Age (mean/SD) 71(9) 74(11) 60(14) 62(12)
Grade
a
High grade 30 11 - -
Low grade 34 19 - -
LG (70%) and HG (30%) 1 - - -
LG (85%) and HG (15%) 1 - - -
PUNLMP 3 - - -
Stage
pT1 13 6 - -
pT2 9 3 - -
pTa 47 21 - -
Type of surgery
TURBT 68 29 - -
Cystectomy 1 1 - -
Tumor origin
Primary 41 15 - -
Recurrent 28 15 - -
Hematuria
At diagnosis 68 30 - -
At sampling 44 26 - -
Tumor size
<1 7 0 - -
2–3 27 18 - -
>3 14 7 - -
Multifocal/at 11/2 5/0 - -
Multifocality
0 1 0 - -
1 47 21 - -
2–3 8 3 - -
>3 13 7 - -
Previous treatment
BCG 10 4 - -
Tumor histology
Papillary 67 29 - -
Concomitant CIS 1 0 - -
Solid, non-papillary 1 1 - -
Tobacco smoking
Non smoking 47 25 - -
Currently smoking 12 2 - -
Prevoius smoking 9 3 - -
a
Tumors were classied according World Health Organization (WHO)/Inter-
national Society of Urological Pathology (ISUP) classication criteria; BC –
bladder cancer; LG – low-grade; HG – high-grade; PUNLMP - papillary urothelial
neoplasm of low malignant potential; pT1 and pTa – high risk non-muscle
invasive bladder cancer; pT2 – muscle invasive bladder cancer; pT- the stage
has been based on pathological or microscopic ndings; SD: standard deviation.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
4
NMR spectra of controls and cancer samples. Detailed analysis of the
NMR spectra revealed signicant differences in metabolite levels be-
tween BC and NCs urine samples.
NMR datasets were randomly divided into two subsets: a training
data set to train a model (n =69 BC and n =70 NCs) and a validation
data set to assess the validity and robustness of the learned model
Fig. 1. . 1D
1
H NMR spectra of Human Urine
Metabolite Mixtures. (A) Representative 1D
1
H
NMR spectrum of urine metabolites obtained
from a bladder cancer (BC) patient and recor-
ded on a 600 MHz (14 Tesla) solution NMR
spectrometer. The NMR signals of metabolites
whose levels differ signicantly and separate
the BC patient group from the healthy (normal)
control group in PLS-DA scores plots (i.e., VIP
scores >1) are labeled. Overlays of the 1D
1
H
NMR spectra from BC patient urine samples
(blue) and control urine samples (black) are
shown in (B) for the chemical shift region
9.15–9.07 ppm, which includes the NMR sig-
nals of trigonelline, (C) for the chemical shift
region 7.57–7.51 ppm corresponding to hippu-
rate, and (D) for the chemical shift region
5.95–5.55 ppm corresponding to urea. The
intensity-normalized spectral overlays clearly
indicate that the concentrations of these me-
tabolites are lower in the urine metabolite
proles of BC patients compared to healthy
controls.
Fig. 2. Cancer and control urine metabolite proles obtained from
1
H NMR data distinguish BC and NCs samples in the training set. (A,B) The tumor (violet) and
control (orange) urine samples were evaluated using (A) 2D PCA, and (B) OPLS-DA scores. (C) ROC curves of ve distinct metabolites: trigonelline, hippurate, urea,
mannitol and 4-hydroxyphenylacetate. (D-H) Box-whisker plots of selected metabolites levels in urine samples from NCs and BCs. AUC: area under the curve; PC:
primary component; ROC: the receiver operator characteristic.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
5
(n =30 BC and n =30 NCs). Metabolite concentrations from both
groups were statistically analyzed to assess whether differences in
metabolite levels between the patient and control groups were signi-
cant. Findings from this analysis are reported in Supplementary data
Tables S2 and S3. 2D PCA score plots from both subsets of data revealed
a clear distinction between BC and NC patient groups. In the training set,
the best group separation was observed along principal components 1
and 2 (i.e., PC1 and PC2), which accounted for 41.3% and 7.5% of the
variance, respectively (Fig. 2 A). Separation of cancer and control urine
samples was also observed in validation set, with PC1 and PC2 ac-
counting for 44.6% and 6.5% of the variance, respectively (Fig. S1A).
Fig. 2B and S1B (Supplementary data) show the corresponding 3D PCA
plots for the training and validation sets, respectively. Next, a supervised
OPLS-DA analysis was performed to investigate the extent of the meta-
bolic differences between the BC and NC groups in both the training
(Fig. 2 C) and validation (Fig. S1C) data sets. Resulting score plots
indicated signicant separate clustering of the two groups in the OPLS-
DA modeling conducted using both the training and validation data sets.
To evaluate the statistical robustness of the OPLS-DA modeling, two
thousand permutation tests were performed (Fig. S2). In the training set,
good discrimination was detected between the two groups (Q
2
=0.633,
R
2
Y=0.728, P-value 5E-04 (0/2000)), revealing substantial differences
in the metabolic proles of BC versus NC urine samples (Fig. S2A,
Supplementary data). The permutation test validated that the group
separations observed in the OPLS-DA modeling of the validation NMR
metabolite dataset is not overt (Q
2
=0.412, R
2
Y=0.603, P-value 5E-04
(0/2000)) (Fig. S2 C, Supplementary data).
Area under the curve AUROC analysis was performed on both the
training and validation data sets to assess the diagnostic performance of
the OPLS-DA models, together with the examination of VIP plots
resulting from the OPLS-DA modeling. These analyses were used to
identify potential urine metabolite biomarkers of bladder cancer. Next,
to examine the statistical signicance of metabolite level differences, the
paired parametric t-test with Mann-Whitney and Bonferroni correction
was utilized. Fifteen urine metabolites were found to be signicant
discriminators of BC versus NC, and were identied from a combined
analysis of VIP scores (>1.0), t-tests (FDR corrected p-values <0.05),
and area under the curve ROC analysis (AUC >0.7) of training set
metabolite data (Table 2, Supplementary data). In turn, sixteen metab-
olites were deemed signicant from a similar analysis of the validation
data set (Supplementary data, Table S2). In both the training and vali-
dation sets, these analyses revealed twelve metabolites that were
consistently found to be signicant discriminators of the BC versus NC
groups. Finally, 5 metabolites were identied as being statistically sig-
nicant based on fold change ratios greater than 2 or less than 0.5. These
included trigonelline, hippurate, urea, mannitol and 4-hydroxyphenyla-
cetate. The diagnostic value of these ve identied metabolites was
evaluated using receiver operating characteristic curve (ROC) analyses
and random forest modeling. The classication ROC model, (Fig. 2E and
Supplementary data Fig. S1E) indicated that including these ve me-
tabolites was a good discriminator (AUC >0.828) of the two groups in
both data sets. The ROC model was validated (See Supplementary data
Fig. S3) and a permutation test using 1000 permutation steps provided a
p-value of 0.009, supporting the validity of the ROC analysis. The best
ROC analyses with the highest signicance (AUC >0.8) were obtained
in the training set for trigonelline (AUC =0.887, specicity =75%, and
sensitivity =80%), urea (AUC =0.858, specicity =86, and sensitivity
=80), mannitol (AUC =0.806, specicity =84, and sensitivity =69)
Table 2
Results of targeted quantitative study of potential BC biomarkers derived from
1
H NMR data of urine samples (P-value 0.05; VIP >1.0; AUC >0.70, FC >2.0 or <0.5).
Comparison mode Metabolite VIP
a
P-value
b
FDR
b
FC
c
AUC Spec. [%]
d
Sens. [%]
d
BC
vs.
NCs
4-Hydroxyphenylacetate 1.57 5.32E-10 5.45E-09 0.485 0.805 72 80
Hippurate 1.59 4.03E-09 2.75E-08 0.360 0.789 81 67
Mannitol 1.46 4.53E-10 5.45E-09 0.238 0.807 84 69
Trigonelline 2.09 3.28E-15 1.34E-13 0.196 0.887 75 89
Urea 1.62 3.41E-13 6.98E-12 0.390 0.858 86 80
HG BC
vs.
NCs
Trigonelline 1.88 6.74E-10 2.76E-08 0.179 0.897 81 79
Hippurate 1.37 1.46E-05 5.43E-05 0.342 0.779 67 76
Mannitol 1.29 1.10E-06 9.05E-06 0.222 0.813 80 72
LG BC
vs.
NCs
Trigonelline 1.94 6.53E-10 2.68E-08 0.226 0.869 88 75
Hippurate 1.55 2.58E-06 1.76E-05 0.400 0.781 71 81
Mannitol 1.41 1.21E-06 1.24E-05 0.254 0.790 68 83
pTa BC
vs.
NCs
Trigonelline 1.98 9.37E-12 3.84E-10 0.234 0.872 88 77
4-Hydroxyphenylacetate 1.56 8.79E-08 8.02E-07 0.499 0.792 80 71
Hippurate 1.56 2.76E-07 1.61E-06 0.395 0.780 68 81
Mannitol 1.45 9.74E-09 1.33E-07 0.228 0.813 68 85
1-Methylhistidine 1.41 9.79E-08 8.02E-07 0.494 0.791 71 79
Creatine 1.28 1.07E-06 4.37E-06 0.476 0.766 75 73
pT1 BC
vs. NCs
Trigonelline 1.85 7.61E-09 3.12E-07 0.130 0.920 91 84
1,3-Dimethylurate 1.66 1.08E-07 2.22E-06 0.210 0.886 81 90
Urea 1.59 2.09E-07 2.86E-06 0.455 0.877 82 79
Hippurate 1.52 1.81E-06 1.48E-05 0.248 0.847 79 79
4-Hydroxyphenylacetate 1.43 1.74E-06 1.48E-05 0.368 0.847 80 79
Glycine 1.31 0.0002 0.0007 0.461 0.775 81 74
Citrate 1.30 1.97E-05 0.0001 0.436 0.810 88 68
Acetate 1.25 0.0003 0.0008 4.930 0.762 71 74
Formate 1.24 0.0002 0.0007 0.499 0.768 75 74
Mannitol 1.15 2.21E-05 0.0001 0.209 0.808 79 68
pT2 BC
vs. NCs
Urea 2.21 2.53E-05 0.0008 0.454 0.874 87 83
1-Methylhistidine 2.11 0.0012 0.0097 0.420 0.788 71 75
Creatinine 1.82 0.0019 0.0132 0.497 0.775 90 67
Trigonelline 1.77 3.92E-05 0.0008 0.201 0.865 76 83
Hippurate 1.50 0.0009 0.0093 0.323 0.795 80 67
Creatine 1.32 0.0065 0.0297 0.469 0.742 89 58
Mannitol 1.23 0.0009 0.0093 0.215 0.795 82 67
a
VIP scores derived from OPLS-DA model;
b
P-value and FDR determined from Student’s t-test,
c
fold change between cancer and control urine calculated from the
concentration mean values for each group – cancer-to-normal ratio;
d
ROC curve analysis for individual biomarkers. AUC: area under the curve; FC: fold change; FDR:
false discovery rate; NCs: normal controls; pT1 and pTa – high risk non-muscle invasive bladder cancer; pT2 – muscle invasive bladder cancer; Sens.: sensitivity; Spec.:
specity; VIP: variable importance in projection scores.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
6
and 4-hydroxyphenylacetate (AUC =0.805, specicity =72, and
sensitivity =80). Fig. 2D-H present the box-whisker plots for all ve
selected metabolites whose levels differed signicantly in the urine
samples of BC versus NC individuals. Table 2 reports the statistical pa-
rameters for these 5 metabolites identied by
1
H NMR as potential
biomarkers of BC. These results indicate that, when considered together,
these ve metabolites have increased diagnostic potential and may be
useful discriminators of malignant versus healthy phenotypes for in-
dividuals with bladder cancer.
3.2. Differentiation between grades of BC and control urine based on
1
H
NMR metabolite proles
PCA, non-parametric OPLS-DA, and one-way ANOVA analyses were
performed on training and validation data sets to investigate whether
1
H
NMR metabolite proles of urine extracts could differentiate between
bladder cancer tumor grades and controls. The BC grade analysis
included 95 urine samples from patients with high-grade (HG) and low-
grade (LG) cancer, with three samples from papillary urothelial
neoplasm of low malignant potential (PUNLMP) patients excluded. NMR
datasets were divided like previously into two subsets: a training data set
to train a model (n =29 HG, n =36 LG, and n =69 NCs) and a vali-
dation data set to assess the validity and robustness of the learned model
(n =11 HG, n =18 LG and n =30 NCs). In both the training and vali-
dation sets, PCA and OPLS-DA scores plots indicated a good separation
between control and cancer groups with different grades of tumors (LG
vs. NCs and HG vs. NCs) (Fig. 2). However, in the PCA scores plot, the
difference between the LG and HG BC patients was marginal (data not
shown). In the LG BC vs. NCs OPLS-DA model, 3 metabolites were
considered signicant (VIP >1, P-value, FDR <0.05, FC <0.5 or >2.0,
Fig. 3. Analysis of the urine metabolite proles
obtained from the
1
H NMR training dataset and
assessment of whether metabolite differences
can be used to differentiate between various
grades of bladder cancer and control samples.
(A) PCA and (B) OPLS-DA score plots of HG BC
(violet) and control (orange) urine samples. (C)
PCA and (D) OPLS-DA score plots of LG BC
(green) and control (orange) urine samples. (E -
G) The box-and-whisker plots of selected me-
tabolites were observed in the control, HG, and
LG BC urine samples. HG: high-grade; LG: low-
grade; PC: primary component;.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
7
AUC >0.7) including trigonelline, hippurate, mannitol, for both the
training set and the validation set (Table 2). All three metabolites were
found in higher concentrations in the urines of NCs group compared to
the BC patients. Analysis of HG BC vs. NCs in the training and validation
sets of the OPLS-DA model indicated that these three metabolites were
signicant to separating the HG BC from the NC group (Table 2). Fig. 3
displays PCA and OPLS-DA scores plots resulting from this analysis, and
illustrates the extent of the separation of HG, LG, from NCs, resulting
from the differential urine metabolite proles in the training and in
validation datasets. Although unsupervised PCA analysis did not clearly
separate the groups based on distinct tumor grades, the cancer groups
separated clearly from the NC group.
3.3. Differentiation between stages of BC and control based on
1
H NMR
metabolite prole analyses of patient and control urine samples
To differentiate between the various stages of bladder cancer, the
complete metabolite concentration dataset obtained from the NMR
studies and measured in the urine samples of patients with different
stages of BC and normal controls was subjected to PCA, OPLS-DA, and
non-parametric one-way ANOVA analyses. The complete set of metab-
olite proles was used to evaluate whether differences in metabolite
concentrations could be used to separate urine samples based on distinct
BC tumor stages. 87 patients with non-muscle invasive bladder cancer
(pTa and pT1) and 12 patients with muscle invasive bladder cancer
(pT2) provided urine samples that were used in this analysis. A training
data set was created with n =48 pTa and n =69 NCs. A validation data
Fig. 4. Analysis of training set urine metabolite proles obtained from
1
H NMR to evaluate whether distinct metabolite patterns separate urine sample groups based
on distinct stages of bladder cancer and control. (A) PCA and (B) OPLS-DA score plots of pTa BC (blue) and control (orange) urine samples. (C) PCA and (D) OPLS-DA
score plots of pT1 BC (violet) and control (orange) urine samples. (E) PCA and (F) OPLS-DA score plots of pT2 BC (green) and control (orange) urine samples. (G - K)
The box-and-whisker plots of selected metabolites were observed in control, pTa, pT1, and pT2 BC urine samples.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
8
set with n =20 pTa, and n =30 NCs was then used to evaluate the
validity and robustness of the trained model. Due to the limited number
of samples, analysis of the pT1 and pT2 stage of BC was performed
without dividing it into two sets (70 NCs, 12 patients with pT2 and 34
with pT1). The PCA and OPLS-DA score plots indicated a good separa-
tion between NCs and the various stages of BC (pTa vs. NCs, pT1 vs. NCs,
and pT2 vs. NCs, Fig. 4). The performance of three models to differen-
tiate between pTa, pT1, and pT2 bladder cancer stages and NCs was then
evaluated using ROC curve analysis. Based on the cut-off criteria (FC >2
or <0.5, VIP >1; AUC >0.7, P-value and FDR <0.05), 6, 10, and 7
metabolites were found to be most signicant for sample distinction
between pTa BC vs. NCs, pT1 BC vs. NCs, and pT2 BC vs. NCs, respec-
tively (Table 2). However, the urine metabolomes could not themselves
distinguish between the three cancer stage groups (pT1 versus pTa
versus pT2), as no metabolite pattern differences were found to be sta-
tistically signicant (Fig. 4G-4 J).
3.4. Untargeted metabolic proling of urine with PFL-2D GS LASiS
AuNPs and
109
AgNPs LDI-MS
Both gold and silver-109 nanoparticle-coated targets were utilized
for laser mass spectrometry-based proling of urine metabolites
collected from patients diagnosed with bladder cancer and control in-
dividuals. PFL-2D GS LASiS AuNPs and
109
AgNPs LDI-MS (pulsed ber
laser ablation synthesis of gold and solver-109 nanoparticles in solution
with the use of a 2D galvoscanner) were employed for the analysis of 200
urine samples, which resulted in the identication of 690 differentially
regulated mass spectral features. The data was randomly split into two
subsets for statistical analysis. The training data set consisted of n =70
BC and n =70 NCs and the validation data set was comprised of n =30
BC and n =30 NCs. 2D-PCA and OPLS-DA scores plots were generated
from multivariate statistical analysis of PFL-2D GS LASiS AuNPs and
109
AgNPs LDI-MS mass spectral features. These analyses provided a clear
separation of the BC group from the NC control group, as a result of their
distinct MS-based urine metabolite proles (see Supplementary data
Figs. S6, S7). OPLS-DA VIP scores >1.0, associated with the OPLS-DA
models, were selected to identify mass spectral features that were
most discriminatory of the BC and NC groups. For the training dataset,
the validation of the OPLS-DA model using 2000 permutations resulted
in R
2
Y and Q
2
values of 0.926 (p <5E04) and 0.971 (p <5E04)
(Fig. S6), while R
2
Y and Q2 values of 0.867 (p <5E04) and 0.965
(p <5E04), respectively, were measured when analyzing the MS
metabolomics data present in the validation dataset. This analysis was
followed by univariate ROC analysis for both training and validation
datasets. Only m/z values with an AUC greater than 0.7 were chosen for
the next step of the analysis. Seventy-four features were common be-
tween the training and the validation datasets, and exhibited VIP values
>1.0, FDR-corrected p-values <0.05, fold change (FC) less than 0.5 or
greater than 1.8, and AUC >0.7. Of these 74 common mass spectral
features, were more abundant in the urine of BC patients to control in-
dividual, while 48 exhibited the opposite trend. Multivariate ROC plot-
based exploratory analysis, based on Random Forest algorithm, was then
carried out to identify which m/z spectral features were most discrimi-
natory between the BC and control groups. Supplementary data Fig. S10
presents a summary of all the ROC curves generated from analysis of the
training and validation datasets, using a range of feature counts (ve,
ten, fteen, twenty-ve, fty, and one hundred), together with associ-
ated AUC values and condence intervals. The 50-feature panel of model
5 in the training set and the 100-feature panel of model 6 in the vali-
dation set provided a very good discrimination power for BC diagnosis
(AUC >0.97) (Fig. S8, Supplementary material).
The data generated from untargeted PFL-2D GS LASiS AuNPs LDI-MS
experiments were also analyzed using PCA and OPLS-DA to identify the
mass spectral features that most differentiated control from BC tumor
groups, using both training and validation datasets. In both instances,
PCA and OPLS-DA scores plots separated clearly BC from control, in both
training and validation data subsets, suggesting that PFL-2D GS LASiS
AuNPs LDI-MS-based metabolite proling of urine can also be used to
effectively to identify characteristic metabolic differences that separate
bladder cancer from control groups (see Supplementary data Fig. S11
and S12). Validation of the OPLS-DA model using 2000 random per-
mutation steps resulted in R
2
Y and Q
2
values of 0.836 (p <5E04) and
0.881 (p <5E04), respectively for the training dataset (see e Supple-
mentary data Fig. S9, and values of 0.720 (p <5E04) and 0.879
(p <5E04) for the validation dataset (Supplementary data Fig. S10).
After completing this analysis, univariate as well as multivariate ROC
analyses were carried out. In the analysis of both subsets (training and
validation sets), 98 common features were found with VIP scores >1.0,
FDR-corrected P-value <0.05, an FC <0.5 or >1.8, and AUC >0.7. Of
these 98 features, 49 spectral features were more abundant in urine
samples of bladder cancer patients compared to control individuals, and
49 features exhibited the opposite trend (less abundant in BCs than NCs).
Fig. S11 provides a comprehensive summary of all the ROC curves
generated from the training and validation datasets using a range of
feature counts (ve, ten, fteen, twenty-ve, fty, and one hundred),
along with corresponding AUC values and condence intervals for each
curve. The 100-feature panel of model 6 of the training dataset yielded
the highest accuracy, while the 10-feature panel of model 2 of the
validation dataset displayed the highest accuracy. Next, putative com-
pound identication of select mass spectral features observed in the PFL-
2D GS LASiS
109
Ag and AuNPs LDI-MS spectra were performed by
searching against various metabolite databases, such as the Human
Metabolome Database (HMDB) [37], the MetaCyc Metabolic Pathway
Database [38], and the LIPID MAPS® Lipidomics Gateway [39].
Twenty-ve mass spectral features were assigned to putative metabolite
IDs by comparing the spectral features observed in PFL-2D GS LASiS
109
AgNPs and AuNPs LDI-MS mass spectra with those of compounds
present the databases mentioned above. All this information is reported
in Supplementary data Table S4.
3.5. Biomarker candidates in cancer: a pathway analysis
A metabolic pathway impact analysis was conducted using Metab-
oAnalyst 5.0 to identify metabolic pathways that are most likely impli-
cated in the observed differences in urine metabolite levels between BCs
and NCs. Pathway analysis and quantitative pathway enrichment anal-
ysis were performed on thirty-nine metabolites that were identied by
NMR or LDI MS. Sixteen of these metabolites were found in the KEEG
database and determined to be endogenous, while others may have
come from various exogenous sources or gut microbe activity. Two
different metabolic pathways were found to be signicantly impacted,
and included pathways involved in glyoxylate and dicarboxylate meta-
bolism, and glycine, serine and threonine metabolism. Each of these
pathways displayed an impact value >0.1 and a p-value <0.05. Fig. 5A
and Supplementary data Table S5 summarize the ndings resulting from
these metabolic pathway impact analyses.
In order to broaden the extent of metabolic pathways impacted in
bladder cancer, a quantitative enrichment analysis was employed using
the MetaboAnalyst 5.0 metabolite route enrichment module and its
associated Small Molecule Pathway Database (SMPDB). The pathway
involved in arginine and proline metabolism was found to be third
impacted pathway with p-values <0.05 and to be relevant to bladder
cancer (Fig. 4B and Table S6 in Supplementary data).
4. Discussion
Analysis of the metabolite proles of urine samples obtained from BC
patients and control individuals using NMR, ICP-OES, and LDI-MS with
both
109
AgNPs and AuNPs-based targets indicated signicant changes in
metabolite levels between patients with BC and controls. In this study,
39 small molecules were identied that may serve as diagnostic in-
dicators of bladder cancer. Twelve of these compounds were present in
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
9
higher concentrations and twenty-seven at lower concentrations in the
urine of BC patients compared to controls (see Tables S2,3 in Supple-
mentary data). The higher concentration of these 15 metabolites may
reect the increased production of tumor metabolites that are secreted
into the urine or may arise from the breakdown or change in the
structure of non-malignant tissue caused by tumor invasion through the
epithelial wall. Inammatory responses due to the presence of the tumor
may also lead to increased levels of some urine metabolites. The
1
H NMR
metabolomics data revealed 5 compounds that were in higher concen-
tration in the urine of NCs than in the BC subjects and signicantly
discriminated between BC and NC groups. These included 4-hydroxy-
phenylacetate, hippurate, mannitol, trigonelline and urea,
One of the metabolites that separated the NC and BC groups, and
exhibited a high VIP value included trigonelline, a product of niacin
(vitamin B3) metabolism which is excreted in the urine. This compound
occurs also in plants and many foods [40]. Trigonelline has been shown
to affect the activity of crucial glucose and lipid metabolism enzymes.
Moreover, this compound has been tested for anticancer activity. Trig-
onelline had an inhibitory effect on the invasion of hepatoma cancer
cells [41]. Trigonelline is also an effective Nrf2 inhibitor in anticancer
activity and increases the sensitivity of chemoresistant pancreatic cell
lines to anticancer drugs [42]. Research has shown that almost 50% of
the dietary intake of trigonelline is excreted in urine within 8 h
following food ingestion [43]. In our studies, the urine level of trig-
onelline was lower in BC patients compared to NCs. This compound has
also been previously detected in lower amounts in the urine of BC pa-
tients and suggested to be a potential bladder cancer biomarker [44–46].
Analogous results, whereby trigonelline levels were found to be reduced,
have been reported in metabolomics studies of urine samples obtained
from lung cancer patients and individuals suffering from acute kidney
injury [47,48].
Urea, formed in the liver from ammonia via the urea cycle, was
another metabolite whose level differences contributed to the separation
of the BC group from the NC group. Urea is also the end product of
protein catabolism and is excreted in the urine. High urea concentra-
tions can cause gastrointestinal bleeding and dehydration in the human
body, while lower urea levels can cause liver failure, nephrotic syn-
drome, and cachexia [49]. Furthermore, it was found that supplying
urea to cancer cells and blocking the breakdown of urea while accu-
mulating ammonium can effectively kill cancer cells. Our research found
a signicantly lower amount of urea in the urine of BC patients
compared to controls. Similar results were obtained in blood serum
analysis from patients with BC, where urea was found to be a good
discriminator of BC versus control sample groups, and was present in
much greater amounts in the control group [50].
Hippuric acid is a product of the aromatic compound metabolism
and also excreted in the urine. Hippuric acid negatively affects blood
pressure, liver ailments, and Crohn’s disease [51]. In our study, the
levels of hippuric acid were reduced in the urine of BC patients
compared to the levels found in NCs, which is consistent with previous
reports [20]. This relation has also been conrmed by several untargeted
metabolomic proling studies of BC urine and serum samples [44,50,52,
53].
4-Hydroxyphenylacetate is a common human, fungal, and plant
metabolite. In our study the urine level of 4-hydroxyphenylacetate was
lower in BC patients, which is consistent with a prior NMR study [54].
Furthermore, 4-hydroxyphenylacetate has also been shown to be
excreted at lower levels in the urine of kidney cancer patients compared
to the amount excreted by control individuals [55,56].
Another potentially important marker of BC is the polyhydroxy sugar
alcohol, mannitol. Urine mannitol levels have been measured using
various analytical methods [57–59]. In one study, human plasma and
urine samples were collected from individuals suffering from impaired
GI function, where mannitol was reported to be a potential biomarker of
impaired intestinal permeability [60]. Our analysis found that the urine
level of mannitol is higher in NC patients than BCs. Similarly, Lee et al.
has shown that mannitol levels differ signicantly in patients with uri-
nary cancers compared levels found in urine samples of control in-
dividuals [54]. Mannitol has previously been reported to be in much
lower concentrations in the urine of patients with various stages of BC
[61], which is consistent with our ndings.
Using modied gold and silver-109 targets in LDI-MS experiments
made it possible to measure urine samples directly without separating
and extracting analytes rst. Using these methods, MS analysis of urine
metabolites identied 16 compounds that were in higher concentration
in urine samples of BC patients compared to controls, and 10 compounds
that were lower in concentration. Most of these compounds were puta-
tively identied as peptides and lipids. Two of the four lipids found to be
elevated in the urine of BC patients belonged to the fatty acyl class, while
the other two lipids belong to the class of sphingolipids and were found
Fig. 5. The ndings of a pathway topology study on the most statistically signicant metabolites found in NMR and MS analyses. (A) Pathway analysis using the
KEGG database; circle size is correlated with inuence of pathway; color indicate the relevance ranging from the highest in red to the lowest in white. (B) A
quantitative examination of enrichment from Small Molecule Pathway Database.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
10
in higher concentrations in the urine of NCs. These ndings validate our
earlier research results, which focused on the metabolite proling of
blood serum samples from BC patients and NC individuals [32].
In many processes associated with cancer cells, lipid metabolism
plays an important role. Fatty acids are the fundamental components of
complex lipids, which can be utilized for energy storage or can serve as
fundamental components of cellular membranes [62]. Changes in lipid
metabolism have been linked to both the early stages and progression of
BC [63], as documented by a number of investigators [64]. Sphingoli-
pids are lipids comprised of sphingoid bases, which are aliphatic amino
alcohols and include sphingosine. Sphingolipids are known to play a
signicant role in the regulation of a variety of cellular processes,
including cellular apoptosis, proliferation, angiogenesis, senescence,
and cellular transformation [65]. The signicance of sphingolipids in
the control of cancer growth and the development of cancerous pa-
thology has been extensively discussed in the scientic literature [88]. It
has been suggested that sphingolipids metabolism plays a role in cancer
aggressiveness and motility of cancer cells in muscle-inltrating bladder
cancer [66].
In an effort to identify cellular markers that could distinguish be-
tween the various grades of BC, several articles have been published that
report on the metabolomics studies of urine and blood of BC patients
[12,13]. To our knowledge, however, only three studies have investi-
gated the connections between changes in metabolite levels in urine and
the distinct stages of tumor development (Ta/Tis, T1, and >T2) [18,19,
67]. In our study, slightly higher concentrations of trigonelline, hippu-
rate, and mannitol were measured in the urine of NCs compared to the
levels found in HG and LG BC groups (Fig. 3, Table 2).
Our study demonstrated that urine-based metabolite proling can
accurately discriminate different stages of BC (pTa, pT1, and pT2) from
NCs (Table 2, Fig. 4). In the urine of patients with pTa, pT1, and pT2
stages of BC, we identied 13 signicant metabolites that were good
discriminators of the different cancer stage groups from the control
group. Our research identied 6 compounds that distinguished BC pa-
tients with pTa from the control group, which included trigonelline, 4-
hydroxyphenylacetate, hippurate, mannitol, 1-methylhistidine, crea-
tine. In addition to the previously described compounds, 1-methylhisti-
dine and creatine deserves attention. Differential levels of 1-
methylhistidine in the urine of BC patients compared to healthy con-
trols has been associated with increased risk of BC recurrence [61,68].
Previous studies have shown that creatinine levels are lower in the
serum and urine of BC patients compared to healthy controls [50,53].
However, there have been studies suggesting that this compound is
present in elevated level in the urine and tissues of BC patients compared
to controls [69,70]. The reason for these contradictory ndings is un-
clear, although our results are consistent with previous studies that
found lower levels of this compound in the urine of BC patients.
Of all ten potential urine-derived bladder cancer of pT1 stage
markers identied by our team, acetate deserves attention. Recent
studies have shown that acetate is a key substrate in tumor bio-
energetics. At the heart of acetate utilization in cancer is the enzyme
ACSS2, responsible for converting acetate to acetyl-CoA. Acetyl-CoA
production is critical for maintaining fatty acid synthesis in cancer cells.
Fatty acid metabolism is a critical aspect of cancer metabolism because
cancer cell proliferation requires the synthesis of numerous cellular
building blocks. It is also interesting to note that in bladder cancer there
may also be changes in lipid or fatty acid metabolism. Glucose-derived
endogenous acetate contributes to fatty acid synthesis in cisplatin-
resistant cells [71]. In addition, the increasing use of
11
C-acetate posi-
tron emission tomography in clinics provides supporting evidence for
the importance of acetate metabolism in cancer.
11
C-acetate is used in
PET/MRI imaging and displays moderate accuracy in primary BC stag-
ing and limited sensitivity in detecting metastatic lymph nodes and
response to neoadjuvant chemotherapy [72]. Moreover, PET/MRI im-
aging is able to reach specicity and sensitivity levels of 50% and 80%,
respectively, for detecting lymph node metastasis [73]. Our study
reports a clear correlation between the level of acetate in the urine and
grade of bladder cancer tumor malignancy.
5. Conclusion
We have demonstrated that multivariate statistics, together with
high-resolution NMR and gold/silver-109-based high-resolution LDI-MS
metabolomics, are powerful analytical techniques to investigate urine
metabolomes and changes in metabolite proles in BC patients.
1
H NMR
metabolomics was employed to assess the urine metabolite patterns of
99 patients with BC and 100 NCs. This led to the identication of ve
potentially robust metabolic indicators of BC, which include 4-hydroxy-
phenylacetate, hippurate, mannitol, trigonelline, and urea. The combi-
nation of these metabolites predicted BC with potentially excellent
predictive power as revealed by AUC values greater than 0.82. Most of
these compounds have been previously linked with bladder cancer,
however until now, they have not been reported in such a combination
as a potential set of discriminating markers of this disease. In addition,
metabolite proling using gold and silver-109 nanoparticle-based laser
desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) identied 26 addi-
tional compounds, the majority of which were lipids, which helped
differentiate between cancer and control urine samples. In addition,
three additional metabolites were found to be potentially valuable dis-
criminators of LG versus HG bladder cancer, and thirteen were potential
reporters of pTa/pT1 and pT2 phases of BC. The distinct metabolite
proles observed in the urine of patients with BC compared to those of
NCs may thus serve as diagnostic markers of BC and may help distin-
guish between the various stages and grades of BC. Results of this study
also suggest that evaluating disease severity and progression in BC using
a combination of urine metabolites has better predictive potential than
using either metabolite alone.
CRediT authorship contribution statement
Krzysztof Ossoli´
nski: Investigation, Resources, Writing – original
draft. Tomasz Ruman: Methodology, Investigation, Resources, Data
curation, Writing – review & editing, Supervision. Valerie Copie: Re-
sources, Data curation, Writing – review & editing, Funding acquisition.
Brian P. Tripet: Resources, Data curation, Writing – review & editing,
Visualization, Funding acquisition. Artur Kołodziej: Investigation, Data
curation. Aneta Płaza-Altamer: Investigation, Data curation. Anna
Ossoli´
nska: Resources. Tadeusz Ossoli´
nski: Resources. Anna Nieczaj:
Writing – original draft. Joanna Nizioł: Conceptualization, Methodol-
ogy, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing – original
draft, Writing – review & editing, Visualization, Supervision, Project
administration, Funding acquisition.
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing nancial
interests or personal relationships that could have appeared to inuence
the work reported in this paper.
Acknowledgments
Research was supported mainly by National Science Centre (Poland),
research project SONATA Number UMO-2018/31/D/ST4/00109.
1
H
NMR spectra were recorded at Montana State University-Bozeman on a
cryoprobe-equipped 600 MHz (14 Tesla) AVANCE III solution NMR
spectrometer housed in MSU’s NMR Center. Funding for MSU NMR
Center’s NMR instruments has been provided in part by the NIH SIG
program (1S10RR13878 and 1S10RR026659), the National Science
Foundation (NSF-MRI:DBI-1532078, NSF-MRI CHE: 2018388), the
Murdock Charitable Trust Foundation (2015066:MNL), and support
from the ofce of the Vice President for Research, Economic Develop-
ment, and Graduate Education at MSU.
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
11
Appendix A. Supporting information
Supplementary data associated with this article can be found in the
online version at doi:10.1016/j.jpba.2023.115473.
References
[1] H. Sung, J. Ferlay, R.L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A. Jemal, F. Bray,
Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality
worldwide for 36 cancers in 185 countries, CA Cancer J. Clin. 71 (2021) 209–249,
https://doi.org/10.3322/CAAC.21660.
[2] M. Horstmann, R. Witthuhn, M. Falk, A. Stenzl, Gender-specic differences in
bladder cancer: a retrospective analysis, Gend. Med 5 (2008) 385–394, https://doi.
org/10.1016/J.GENM.2008.11.002.
[3] A.M. Grimaldi, C. Lapucci, M. Salvatore, M. Incoronato, M. Ferrari, Urinary
miRNAs as a diagnostic tool for bladder cancer: a systematic review, Biomedicines
10 (2022) 2766, https://doi.org/10.3390/BIOMEDICINES10112766/S1.
[4] K. Steinestel, C. Bulai, P. Geavlete, C.-V. Ene, I. Bulai, R.-I. Popescu, C. Mares,
C. Daniela Ene, A.-M. Punga, B. Geavlete, Detection of urinary molecular marker
test in urothelial cell carcinoma: a review of methods and accuracy, 2022, Vol. 12,
Page 2696, Diagnostics 12 (2022) 2696, https://doi.org/10.3390/
DIAGNOSTICS12112696.
[5] C.Z. Zhu, H.N. Ting, K.H. Ng, T.A. Ong, A review on the accuracy of bladder cancer
detection methods, J. Cancer 10 (2019) 4038, https://doi.org/10.7150/
JCA.28989.
[6] N. Goossens, S. Nakagawa, X. Sun, Y. Hoshida, Cancer biomarker discovery and
validation, Transl. Cancer Res 4 (2015) 256, https://doi.org/10.3978/J.
ISSN.2218-676X.2015.06.04.
[7] Y. Soorojebally, Y. Neuzillet, M. Roumigui´
e, P.J. Lamy, Y. Allory, F. Descotes,
S. Ferlicot, D. Kassab-Chahmi, S. Oudard, X. R´
ebillard, C. Roy, T. Lebret,
M. Rouprˆ
et, F. Audenet, Urinary biomarkers for bladder cancer diagnosis and
NMIBC follow-up: a systematic review, World J. Urol. 41 (2023) 345–359, https://
doi.org/10.1007/S00345-022-04253-3/TABLES/3.
[8] H.K. Shefer, I. Masarwe, J. Bejar, L.H. Naamnih, K. Gueta-Milshtein, A. Shalata,
Y. Hadid, O. Nativ, O. Nativ, Performance of CellDetect for detection of bladder
cancer: comparison with urine cytology and UroVysion, Urol. Oncol.: Semin. Orig.
Investig. (2023), https://doi.org/10.1016/J.UROLONC.2022.12.012.
[9] C.H. Johnson, J. Ivanisevic, G. Siuzdak, Metabolomics: beyond biomarkers and
towards mechanisms, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (2016) 451–459, https://doi.org/
10.1038/NRM.2016.25.
[10] P. Ko´
sli´
nski, R. Bujak, E. Daghir, M.J. Markuszewski, Metabolic proling of
pteridines for determination of potential biomarkers in cancer diseases,
Electrophoresis 32 (2011) 2044–2054, https://doi.org/10.1002/ELPS.201000664.
[11] J. Pinto, F. Amaro, A.R. Lima, C. Carvalho-Maia, C. Jer´
onimo, R. Henrique, M.D.
L. Bastos, M. Carvalho, P. Guedes, Urinary volatilomics unveils a candidate
biomarker panel for noninvasive detection of clear cell renal cell carcinoma,
J. Proteome Res 20 (2021) 3068–3077, https://doi.org/10.1021/ACS.
JPROTEOME.0C00936/ASSET/IMAGES/LARGE/PR0C00936_0004.JPEG.
[12] N.A. Di Meo, D. Loizzo, S.D. Pandolfo, R. Autorino, M. Ferro, C. Porta, A. Stella,
C. Bizzoca, L. Vincenti, F. Crocetto, O.S. Tataru, M. Rutigliano, M. Battaglia,
P. Ditonno, G. Lucarelli, Metabolomic approaches for detection and identication
of biomarkers and altered pathways in bladder cancer, Int. J. Mol. Sci. 23 (2022)
4173, https://doi.org/10.3390/IJMS23084173/S1.
[13] G. Petrella, G. Ciufolini, R. Vago, D.O. Cicero, Urinary metabolic markers of
bladder cancer: a reection of the tumor or the response of the body? Metabolites
11 (2021) https://doi.org/10.3390/metabo11110756.
[14] M. Manzi, G. Riquelme, N. Zabalegui, M.E. Monge, Improving diagnosis of
genitourinary cancers: biomarker discovery strategies through mass spectrometry-
based metabolomics, J. Pharm. Biomed. Anal. 178 (2020), https://doi.org/
10.1016/j.jpba.2019.112905.
[15] R. Batista, N. Vinagre, S. Meireles, J. Vinagre, H. Prazeres, R. Le˜
ao, V. M´
aximo,
P. Soares, Biomarkers for bladder cancer diagnosis and surveillance: a
comprehensive review, Diagnostics 10 (2020) 39, https://doi.org/10.3390/
DIAGNOSTICS10010039.
[16] J. Li, B. Cheng, H. Xie, C. Zhan, S. Li, P. Bai, Bladder cancer biomarker screening
based on non-targeted urine metabolomics, 2021 54:1, Int. Urol. Nephrol. 54
(2021) 23–29, https://doi.org/10.1007/S11255-021-03080-6.
[17] M. Qu, S. Ma, Y. Huang, H. Yuan, S. Zhang, G. Ouyang, Y. Zhao, LC-MS/MS-based
non-isotopically paired labeling (NIPL) strategy for the qualication and
quantication of monosaccharides, Talanta 231 (2021), 122336, https://doi.org/
10.1016/j.talanta.2021.122336.
[18] J. Oto, ´
A. Fern´
andez-Pardo, M. Roca, E. Plana, F. Cana, R. Herranz, J. P´
erez-
Ardavín, C.D. Vera-Donoso, M. Martínez-Sarmiento, P. Medina, LC–MS
metabolomics of urine reveals distinct proles for non-muscle-invasive and muscle-
invasive bladder cancer, World J. Urol. 40 (2022) 2387–2398, https://doi.org/
10.1007/S00345-022-04136-7/FIGURES/4.
[19] J. Pinto, ˆ
A. Carapito, F. Amaro, A.R. Lima, C. Carvalho-Maia, M.C. Martins,
C. Jer´
onimo, R. Henrique, M. de, L. Bastos, P.G. de Pinho, Discovery of volatile
biomarkers for bladder cancer detection and staging through urine metabolomics,
Metabolites 11 (2021) 199, https://doi.org/10.3390/metabo11040199.
[20] S. Srivastava, R. Roy, S. Singh, P. Kumar, D. Dalela, S.N. Sankhwar, A. Goel, A.
A. Sonkar, Taurine - A possible ngerprint biomarker in non-muscle invasive
bladder cancer: a pilot study by
1
H NMR spectroscopy, Cancer Biomark. 6 (2009)
11–20, https://doi.org/10.3233/CBM-2009-0115.
[21] A. Loras, C. Su´
arez-Cabrera, M.C. Martínez-Bisbal, G. Quint´
as, J.M. Paramio,
R. Martínez-M´
a˜
nez, S. Gil, J.L. Ruiz-Cerd´
a, Integrative metabolomic and
transcriptomic analysis for the study of bladder cancer, Cancers 11 (2019) 1–36,
https://doi.org/10.3390/cancers11050686.
[22] I.V. Plyushchenko, E.S. Fedorova, N.V. Potoldykova, K.A. Polyakovskiy, A.
I. Glukhov, I.A. Rodin, Omics untargeted key script: r-based software toolbox for
untargeted metabolomics with bladder cancer biomarkers discovery case study,
J. Proteome Res (2021), https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.1c00392.
[23] X. Liu, X. Cheng, X. Liu, L. He, W. Zhang, Y. Wang, W. Sun, Z. Ji, Investigation of
the urinary metabolic variations and the application in bladder cancer biomarker
discovery, Int J. Cancer 143 (2018) 408–418, https://doi.org/10.1002/IJC.31323.
[24] C. Shen, Z. Sun, D. Chen, X. Su, J. Jiang, G. Li, B. Lin, J. Yan, Developing urinary
metabolomic signatures as early bladder cancer diagnostic markers, OMICS 19
(2015) 1–11, https://doi.org/10.1089/omi.2014.0116.
[25] C.H. Shao, C.L. Chen, J.Y. Lin, C.J. Chen, S.H. Fu, Y.T. Chen, Y.S. Chang, J.S. Yu, K.
H. Tsui, C.G. Juo, K.P. Wu, Metabolite marker discovery for the detection of
bladder cancer by comparative metabolomics, Oncotarget 8 (2017) 38802–38810,
https://doi.org/10.18632/oncotarget.16393.
[26] X. Cheng, X. Liu, X. Liu, Z. Guo, H. Sun, M. Zhang, Z. Ji, W. Sun, Metabolomics of
Non-muscle Invasive Bladder Cancer: biomarkers for early detection of bladder
cancer, Front Oncol. 8 (2018) 1–11, https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00494.
[27] J. Nizioł, K. Ossoli´
nski, A. Płaza-Altamer, A. Kołodziej, A. Ossoli´
nska, T. Ossoli´
nski,
T. Ruman, Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic
proling of blood serum in bladder cancer, 2022 12:1. 12, Sci. Rep. (2022) 1–13,
https://doi.org/10.1038/s41598-022-19576-9.
[28] M. Baker, Metabolomics: from small molecules to big ideas, 2011 8:2. 8, Nat.
Methods (2011) 117–121, https://doi.org/10.1038/nmeth0211-117.
[29] K. Segers, S. Declerck, D. Mangelings, Y. Vander Heyden, A. Van Eeckhaut,
Analytical techniques for metabolomic studies: a review, Bioanalysis 11 (2019)
2297–2318, https://doi.org/10.4155/bio-2019-0014.
[30] A. Płaza, A. Kołodziej, J. Nizioł, T. Ruman, Laser ablation synthesis in solution and
nebulization of silver-109 nanoparticles for mass spectrometry and mass
spectrometry imaging, ACS Meas. Sci. Au 2 (2021) 14–22, https://doi.org/
10.1021/ACSMEASURESCIAU.1C00020.
[31] J. Nizioł, K. Ossoli´
nski, B.P. Tripet, V. Copi´
e, A. Arendowski, T. Ruman, Nuclear
magnetic resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass
spectrometry-based metabolome proling of urine samples from kidney cancer
patients, J. Pharm. Biomed. Anal. 193 (2021), 113752, https://doi.org/10.1016/j.
jpba.2020.113752.
[32] K. Ossoli´
nski, T. Ruman, V. Copi´
e, B.P. Tripet, L.B. Nogueira, K.O.P.C. Nogueira,
A. Kołodziej, A. Płaza-Altamer, A. Ossoli´
nska, T. Ossoli´
nski, J. Nizioł, Metabolomic
and elemental proling of blood serum in bladder cancer, J. Pharm. Anal. (2022),
https://doi.org/10.1016/J.JPHA.2022.08.004.
[33] J. Nizioł, K. Ossoli´
nski, B.P. Tripet, V. Copi´
e, A. Arendowski, T. Ruman, Nuclear
magnetic resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass
spectrometry-based serum metabolomics of kidney cancer, Anal. Bioanal. Chem.
(2020) 1–15, https://doi.org/10.1007/s00216-020-02807-1.
[34] Z. Pang, J. Chong, G. Zhou, D.A. De Lima Morais, L. Chang, M. Barrette,
C. Gauthier, P.´
E. Jacques, S. Li, J. Xia, MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap
between raw spectra and functional insights, Nucleic Acids Res 49 (2021)
W388–W396, https://doi.org/10.1093/NAR/GKAB382.
[35] J. Nizioł, V. Copi´
e, B.P. Tripet, L.B. Nogueira, K.O.P.C. Nogueira, K. Ossoli´
nski,
A. Arendowski, T. Ruman, Metabolomic and elemental proling of human tissue in
kidney cancer, Metabolomics 17 (2021) 30, https://doi.org/10.1007/S11306-021-
01779-2.
[36] S. Okuda, T. Yamada, M. Hamajima, M. Itoh, T. Katayama, P. Bork, S. Goto,
M. Kanehisa, KEGG Atlas mapping for global analysis of metabolic pathways,
Nucleic Acids Res 36 (2008) W423–W426, https://doi.org/10.1093/NAR/
GKN282.
[37] D.S. Wishart, D. Tzur, C. Knox, R. Eisner, A.C. Guo, N. Young, D. Cheng, K. Jewell,
D. Arndt, S. Sawhney, C. Fung, L. Nikolai, M. Lewis, M.-A. Coutouly, I. Forsythe,
P. Tang, S. Shrivastava, K. Jeroncic, P. Stothard, G. Amegbey, D. Block,
DavidD. Hau, J. Wagner, J. Miniaci, M. Clements, M. Gebremedhin, N. Guo,
Y. Zhang, G.E. Duggan, G.D. MacInnis, A.M. Weljie, R. Dowlatabadi, F. Bamforth,
D. Clive, R. Greiner, L. Li, T. Marrie, B.D. Sykes, H.J. Vogel, L. Querengesser,
HMDB: the human metabolome database, Nucleic Acids Res 35 (2007)
D521–D526, https://doi.org/10.1093/nar/gkl923.
[38] R. Caspi, R. Billington, C.A. Fulcher, I.M. Keseler, A. Kothari, M. Krummenacker,
M. Latendresse, P.E. Midford, Q. Ong, W.K. Ong, S. Paley, P. Subhraveti, P.D. Karp,
The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes, Nucleic Acids Res 46
(2018) D633–D639, https://doi.org/10.1093/nar/gkx935.
[39] M. Sud, E. Fahy, D. Cotter, A. Brown, E.A. Dennis, C.K. Glass, A.H. Merrill, R.
C. Murphy, C.R.H. Raetz, D.W. Russell, S. Subramaniam, LMSD: LIPID MAPS
structure database, Nucleic Acids Res 35 (2007), https://doi.org/10.1093/nar/
gkl838.
[40] H. Ashihara, I.A. Ludwig, R. Katahira, T. Yokota, T. Fujimura, A. Crozier,
H. Ashihara, I.A. Ludwig, ´
A.A. Crozier, R. Katahira, T. Yokota, T. Fujimura,
Trigonelline and related nicotinic acid metabolites: occurrence, biosynthesis,
taxonomic considerations, and their roles in planta and in human health, 2014 14:
5, Phytochem. Rev. 14 (2014) 765–798, https://doi.org/10.1007/S11101-014-
9375-Z.
[41] N. Hirakawa, R. Okauchi, Y. Miura, K. Yagasaki, Anti-invasive activity of niacin
and trigonelline against cancer cells, OUP 69 (2014) 653–658, https://doi.org/
10.1271/BBB.69.653.
[42] A. Arlt, S. Sebens, S. Krebs, C. Geismann, M. Grossmann, M.L. Kruse, S. Schreiber,
H. Sch¨
afer, Inhibition of the Nrf2 transcription factor by the alkaloid trigonelline
K. Ossoli´
nski et al.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 233 (2023) 115473
12
renders pancreatic cancer cells more susceptible to apoptosis through decreased
proteasomal gene expression and proteasome activity, 2013 32:40, Oncogene 32
(2012) 4825–4835, https://doi.org/10.1038/onc.2012.493.
[43] R. Lang, N. Dieminger, A. Beusch, Y.M. Lee, A. Dunkel, B. Suess, T. Skurk, A. Wahl,
H. Hauner, T. Hofmann, Bioappearance and pharmacokinetics of bioactives upon
coffee consumption, Anal. Bioanal. Chem. 405 (2013) 8487–8503, https://doi.org/
10.1007/S00216-013-7288-0/TABLES/4.
[44] Z. Huang, L. Lin, Y. Gao, Y. Chen, X. Yan, J. Xing, W. Hang, Bladder cancer
determination via two urinary metabolites: a biomarker pattern approach,
M111.007922, Mol. Cell. Proteom. 10 (2011), https://doi.org/10.1074/mcp.
M111.007922.
[45] A. Loras, M.C. Martínez-Bisbal, G. Quint´
as, S. Gil, R. Martínez-M´
a˜
nez, J.L. Ruiz-
Cerd´
a, Urinary metabolic signatures detect recurrences in non-muscle invasive
bladder cancer, 2019, Vol. 11, Page 914, Cancers 11 (2019) 914, https://doi.org/
10.3390/CANCERS11070914.
[46] Y.J. Chen, X.H. Wang, Z.Z. Huang, L. Lin, Y. Gao, E.Y. Zhu, J.C. Xing, J.X. Zheng,
W. Hang, A study of human bladder cancer by serum and urine metabonomics,
Chin. J. Anal. Chem. 40 (2012) 1322–1328, https://doi.org/10.1016/S1872-2040
(11)60570-7.
[47] A.J. Won, S. Kim, Y.G. Kim, K.B. Kim, W.S. Choi, S. Kacew, K.S. Kim, J.H. Jung, B.
M. Lee, S. Kim, H.S. Kim, Discovery of urinary metabolomic biomarkers for early
detection of acute kidney injury, Mol. Biosyst. 12 (2015) 133–144, https://doi.org/
10.1039/C5MB00492F.
[48] J. Carrola, C.M. Rocha, A.S. Barros, A.M. Gil, B.J. Goodfellow, I.M. Carreira,
J. Bernardo, A. Gomes, V. Sousa, L. Carvalho, I.F. Duarte, Metabolic signatures of
lung cancer in biouids: NMR-based metabonomics of urine, J. Proteome Res 10
(2011) 221–230, https://doi.org/10.1021/PR100899X/SUPPL_FILE/PR100899X_
SI_001.PDF.
[49] H. Marepula, C.E. Courtney, D.G. Randall, Urea recovery from stabilized urine
using a novel ethanol evaporation and recrystallization process, Chem. Eng. J. Adv.
8 (2021), 100174, https://doi.org/10.1016/J.CEJA.2021.100174.
[50] J. Troisi, A. Colucci, P. Cavallo, S. Richards, S. Symes, A. Landol, G. Scala,
F. Maiorino, A. Califano, M. Fabiano, G. Silvestre, F. Mastella, A. Caputo,
A. D’Antonio, V. Altieri, A serum metabolomic signature for the detection and
grading of bladder cancer, Appl. Sci. 11 (2021) 2835, https://doi.org/10.3390/
APP11062835.
[51] F. Brial, J. Chilloux, T. Nielsen, S. Vieira-Silva, G. Falony, P. Andrikopoulos,
M. Olanipekun, L. Hoyles, F. Djouadi, A.L. Neves, A. Rodriguez-Martinez, G.
I. Mouawad, N. Pons, S. Forslund, E. Le-Chatelier, A. Le Lay, J. Nicholson,
T. Hansen, T. Hy¨
otyl¨
ainen, K. Cl´
ement, M. Oresic, P. Bork, S.D. Ehrlich, J. Raes, O.
B. Pedersen, D. Gauguier, M.E. Dumas, Human and preclinical studies of the
host–gut microbiome co-metabolite hippurate as a marker and mediator of
metabolic health, Gut 70 (2021) 2105–2114, https://doi.org/10.1136/GUTJNL-
2020-323314.
[52] K. Łuczykowski, N. Warmuzi´
nska, S. Operacz, I. Stryjak, J. Bogusiewicz, J. Jacyna,
R. Wawrzyniak, W. Struck-Lewicka, M.J. Markuszewski, B. Bojko, Metabolic
evaluation of urine from patients diagnosed with high grade (Hg) bladder cancer
by spme-lc-ms method, Molecules 26 (2021) 2194, https://doi.org/10.3390/
molecules26082194.
[53] B.M. Wittmann, S.M. Stirdivant, M.W. Mitchell, J.E. Wulff, J.E. McDunn, Z. Li,
A. Dennis-Barrie, B.P. Neri, M.V. Milburn, Y. Lotan, R.L. Wolfert, Bladder Cancer
Biomarker Discovery Using Global Metabolomic Proling of Urine, PLoS One 9
(2014), e115870, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0115870.
[54] S. Lee, J.Y. Ku, B.J. Kang, K.H. Kim, H.K. Ha, S. Kim, A unique urinary metabolic
feature for the determination of bladder cancer, prostate cancer, and renal cell
carcinoma, Metabolites 11 (2021) 591, https://doi.org/10.3390/
metabo11090591.
[55] M.S. Monteiro, A.S. Barros, J. Pinto, M. Carvalho, A.S. Pires-Luís, R. Henrique,
C. Jer´
onimo, M.D.L. Bastos, A.M. Gil, P. Guedes De Pinho, Nuclear Magnetic
Resonance metabolomics reveals an excretory metabolic signature of renal cell
carcinoma, Sci. Rep. 6 (2016) 1–14, https://doi.org/10.1038/srep37275.
[56] K. Kim, S.L. Taylor, S. Ganti, L. Guo, M.V. Osier, R.H. Weiss, Urine metabolomic
analysis identies potential biomarkers and pathogenic pathways in kidney cancer,
OMICS 15 (2011) 293–303, https://doi.org/10.1089/omi.2010.0094.
[57] M. Camilleri, A. Nadeau, J. Lamsam, S. Linker Nord, M. Ryks, D. Burton,
S. Sweetser, A.R. Zinsmeister, R. Singh, Understanding measurements of intestinal
permeability in healthy humans with urine lactulose and mannitol excretion,
Neurogastroenterol. Motil. 22 (2010) e15–e26, https://doi.org/10.1111/J.1365-
2982.2009.01361.X.
[58] P.G. Lunn, C.A. Northrop, A.J. Northrop, Automated enzymatic assays for the
determination of intestinal permeability probes in urine. 2. Mannitol, Clin. Chim.
Acta 183 (1989) 163–170, https://doi.org/10.1016/0009-8981(89)90332-X.
[59] I.R. Sequeira, M.C. Kruger, R.D. Hurst, R.G. Lentle, A simple, robust, and
convenient HPLC assay for urinary lactulose and mannitol in the dual sugar
absorption test, 2022, Vol. 27, Page 2677, Molecules 27 (2022) 2677, https://doi.
org/10.3390/MOLECULES27092677.
[60] M. Alinaghi, D.N. Nguyen, H.C. Bertram, P.T. Sangild, Direct implementation of
intestinal permeability test in NMR metabolomics for simultaneous biomarker
discovery—a feasibility study in a preterm piglet model, 2020, Vol. 10, Page 22,
Metabolites 10 (2020) 22, https://doi.org/10.3390/METABO10010022.
[61] J.V. Alberice, A.F.S. Amaral, E.G. Armitage, J.A. Lorente, F. Algaba, E. Carrilho,
M. M´
arquez, A. García, N. Malats, C. Barbas, Searching for urine biomarkers of
bladder cancer recurrence using a liquid chromatography–mass spectrometry and
capillary electrophoresis–mass spectrometry metabolomics approach,
J. Chromatogr. A 1318 (2013) 163–170, https://doi.org/10.1016/J.
CHROMA.2013.10.002.
[62] C.R. Santos, A. Schulze, Lipid metabolism in cancer, FEBS J. 279 (2012)
2610–2623, https://doi.org/10.1111/J.1742-4658.2012.08644.X.
[63] M.Y. Lee, A. Yeon, M. Shahid, E. Cho, V. Sairam, R. Figlin, K.H. Kim, J. Kim,
Reprogrammed lipid metabolism in bladder cancer with cisplatin resistance,
Oncotarget 9 (2018) 13231, https://doi.org/10.18632/ONCOTARGET.24229.
[64] J. Long, C.-J. Zhang, N. Zhu, K. Du, Y.-F. Yin, X. Tan, D.-F. Liao, L. Qin, Lipid
metabolism and carcinogenesis, cancer development, Am. J. Cancer Res 8 (2018)
778.
[65] H. Furuya, Y. Shimizu, T. Kawamori, Sphingolipids in cancer, 567–76, Cancer
Metastas-.-. Rev. 30 (2011), https://doi.org/10.1007/s10555-011-9304-1.
[66] A. Bettiga, M. Aureli, G. Colciago, V. Murdica, M. Moschini, R. Lucian`
o, D. Canals,
Y. Hannun, P. Hedlund, G. Lavorgna, R. Colombo, R. Bassi, M. Samarani,
F. Montorsi, A. Salonia, F. Benigni, Bladder cancer cell growth and motility
implicate cannabinoid 2 receptor-mediated modications of sphingolipids
metabolism, 2017 7:1, Sci. Rep. 7 (2017) 1–11, https://doi.org/10.1038/
srep42157.
[67] A. Loras, C. Su´
arez-Cabrera, M.C. Martínez-Bisbal, G. Quint´
as, J.M. Paramio,
R. Martínez-M´
a˜
nez, S. Gil, J.L. Ruiz-Cerd´
a, Integrative metabolomic and
transcriptomic analysis for the study of bladder cancer, 2019, Vol. 11, Page 686,
Cancers 11 (2019) 686, https://doi.org/10.3390/CANCERS11050686.
[68] J. Li, B. Cheng, H. Xie, C. Zhan, S. Li, P. Bai, Bladder cancer biomarker screening
based on non-targeted urine metabolomics, Int Urol. Nephrol. 54 (2022) 23–29,
https://doi.org/10.1007/s11255-021-03080-6.
[69] A. Loras, M. Trassierra, D. Sanjuan-Herr´
aez, M.C. Martínez-Bisbal, J.V. Castell,
G. Quint´
as, J.L. Ruiz-Cerd´
a, Bladder cancer recurrence surveillance by urine
metabolomics analysis, Sci. Rep. 8 (2018) 1–10, https://doi.org/10.1038/s41598-
018-27538-3.
[70] P. Tripathi, B.S. Somashekar, M. Ponnusamy, A. Gursky, S. Dailey, P. Kunju, C.
T. Lee, A.M. Chinnaiyan, T.M. Rajendiran, A. Ramamoorthy, HR-MAS NMR tissue
metabolomic signatures cross-validated by mass spectrometry distinguish bladder
cancer from benign disease, J. Proteome Res 12 (2013) 3519–3528, https://doi.
org/10.1021/pr4004135.
[71] H. Wen, S. Lee, W.G. Zhu, O.J. Lee, S.J. Yun, J. Kim, S. Park, Glucose-derived
acetate and ACSS2 as key players in cisplatin resistance in bladder cancer, Biochim
Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids 2019 (1864) 413–421, https://doi.org/
10.1016/J.BBALIP.2018.06.005.
[72] A. Salminen, I. Jambor, H. Merisaari, O. Ettala, J. Virtanen, I. Koskinen,
E. Veskimae, J. Sairanen, P. Taimen, J. Kemppainen, H. Minn, P.J. Bostr¨
om, 11C-
acetate PET/MRI in bladder cancer staging and treatment response evaluation to
neoadjuvant chemotherapy: a prospective multicenter study (ACEBIB trial), Cancer
Imaging 18 (2018), https://doi.org/10.1186/S40644-018-0158-4.
[73] H. Sch¨
oder, S.C. Ong, V.E. Reuter, S. Cai, E. Burnazi, G. Dalbagni, S.M. Larson, B.
H. Bochner, Initial results with 11C-acetate positron emission tomography/
computed tomography (PET/CT) in the staging of urinary bladder cancer, Mol.
Imaging Biol. 14 (2012) 245–251, https://doi.org/10.1007/S11307-011-0488-0/
TABLES/2.
K. Ossoli´
nski et al.
1
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports
Untargeted urinary metabolomics
for bladder cancer biomarker
screening with ultrahigh‑resolution
mass spectrometry
Joanna Nizioł
1*, Krzysztof Ossoliński
2, Aneta Płaza‑Altamer
1,3, Artur Kołodziej
1,3,
Anna Ossolińska
2, Tadeusz Ossoliński
2, Anna Nieczaj
1 & Tomasz Ruman
1
Bladder cancer (BC) is a common urological malignancy with a high probability of death and
recurrence. Cystoscopy is used as a routine examination for diagnosis and following patient
monitoring for recurrence. Repeated costly and intrusive treatments may discourage patients from
having frequent follow‑up screenings. Hence, exploring novel non‑invasive ways to help identify
recurrent and/or primary BC is critical. In this work, 200 human urine samples were proled using
ultra‑high‑performance liquid chromatography and ultra‑high‑resolution mass spectrometry (UHPLC‑
UHRMS) to uncover molecular markers dierentiating BC from non‑cancer controls (NCs). Univariate
and multivariate statistical analyses with external validation identied metabolites that distinguish
BC patients from NCs disease. More detailed divisions for the stage, grade, age, and gender are also
discussed. Findings indicate that monitoring urine metabolites may provide a non‑invasive and more
straightforward diagnostic method for identifying BC and treating recurrent diseases.
Cancer is one of the humanity’s most signicant problems in the twenty-rst century that also occupy thousands
of scientists. Cancer is the leading cause of death among people under 70. Recent trends show that cancer may be
the leading cause of premature death in most countries this century1. Urological cancers constitute a large part of
all types of cancers worldwide. eir incidence and mortality are still increasing, which places a signicant burden
on healthcare worldwide1. e early detection of cancer contributes to early diagnosis and subsequent treatment2.
Bladder cancer (BC) is one of the most common urinary tract cancers aecting men and women3. e inci-
dence of this cancer depends mainly on age, sex, carcinogenic factors, diet, and alcohol consumption or smoking4.
Based on the histological classication, several types of bladder cancer were classied, including non-muscle
invasive bladder cancer (NMIBC), which accounts for about 70–85% of all bladder tumors, and muscle-invasive
BC (MIBC). NMIBC comprises noninvasive papillary carcinomas (pathologic stage Ta), submucosal invasive
tumors (T1), and carcinoma insitu (CIS). MIBC contains tumors that have spread into muscle (stage T2),
perivisceral fat (stage T3), or adjacent organs (stage T4). Histology classies BC as low-grade (LG) tumors that
seldom expand from their source location and high-grade (HG) tumors that are more aggressive and invasive.
Moreover, about 50% of NMIBC cases a, aer all, recur despite radical treatment, and about 30% experience
disease progression to MIBC5. is is why cancer patients are screened mainly for recurrence of the disease and
metastasis of the disease to other sites3.
Transurethral resection of bladder tumor (TURBT), occasionally followed by intravesical instillation of
mitomycin or Bacillus Calmette-Guerin (BCG) therapy, is the standard rst-line treatment for early BC. e
conventional therapy for MIBC, on the other hand, is a radical cystectomy with pelvic lymph node dissection.
is is used with neoadjuvant or adjuvant cisplatin-based chemotherapy6. Despite such rigorous therapy, BC
patients have a dismal survival rate. It is widely known that the sooner the cancer is detected, the greater the
chance of treating the patient7. Some of the varieties of cancer are undetectable at an early stage using cystoscopy.
Incredibly, at, non-invasive with high-grade cancer is practically invisible in cystoscopy. Moreover, it is oen
mistakenly interpreted as a common inammatory area because of its appearance. erefore, metabolomics can
be the most suitable way to achieve this. Due to the direct contact of the tumor with the urine, specic disease
OPEN
1Faculty of Chemistry, Rzeszów University of Technology, 6 Powstańców Warszawy Ave., 35-959 Rzeszów,
Poland. 2Department of Urology, John Paul II Hospital, Grunwaldzka 4 St., 36-100 Kolbuszowa, Poland. 3Doctoral
School of Engineering and Technical Sciences at the Rzeszów University of Technology, 8 Powstańców Warszawy
Ave., 35-959 Rzeszów, Poland. *email: jniziol@prz.edu.pl
2
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
biomarkers may be present in this uid. In recent years, metabolomics research in diagnosing and understanding
numerous illnesses has increased dramatically8.
Several analytical approaches have been developed to understand better the metabolic alterations in biologi-
cal systems, including cancer phenotypic changes. Nevertheless, two analytical platforms—nuclear magnetic
resonance (NMR)9 spectroscopy and mass spectrometry (MS), which are frequently combined with liquid chro-
matography (LC)10, provide the complete screening of cancer metabolomes. MS, compared to NMR, detects far
wider variety of molecules with much greater sensitivity, resolution, and accuracy using much less material11.
During the last een years, metabolomic analytical approaches have been extensively employed to explore BC
and nd possible biomarkers in urine, serum, and tissues4,5,12,13. Compared to serum and tissue, urine metabo-
lomics may be aected by dilution factor, but urine is more available than tissue or serum, and the procedure
non-invasive. Recently, many detailed articles have been published on potential urinary markers of BC, dem-
onstrating signicant interest in this eld14,15. Unfortunately, none of the biomarkers invented and tested so far
guarantee 100% detection of cancer at an early stage. Even though their detection characteristics are still high,
they are associated with enormous costs that the global health service cannot aord16. is is still desirable for
scientists to research subsequent biomarkers, thanks to which we will increase the percentage of cases with early
detection of bladder cancer.
Most investigations of urine from patients with bladder cancer were based on NMR17 or mass spectrometry
coupled to liquid chromatography (LC)18–21 and gas chromatography (GC)22,23. One of the rst report of metabo-
lomic proling of urine from BC patients using high-performance liquid chromatography coupled with mass
spectrometry appeared in 200824. e study was conducted on samples from 41 bladder cancer patients and 48
healthy individuals. e results indicated that metabolomics using HPLC–MS had the potential to become a
noninvasive early detection test for BC. Similar conclusions were drawn in 2011 by Huang and coworkers, who
indicated fourteen compounds dierentiating these two groups based on the urine analysis of 27 patients with BC
and 32 healthy volunteers25. In the same year, urine proling with external validation was performed by Putluri
and coworkers26 on a much larger group of 85 BC patients and 51 controls, indicating 35 potential BC biomark-
ers. In 2013, two more urine proling works were published that were based on a relatively small groups of BC
patients27,28. e rst proling of urine metabolites of a larger group of 138 BC patients and 121 controls using
HPLC-QToF-MS was performed in 2014 by Jin and coworkers29. e research identied 12 dierential metabo-
lites that may be useful for the distinction between the BC and control groups. However, mentioned research
was based on mass spectrometer of 20,000 resolution that is three-times lower value that for instrument used in
our report. Also, authors used 2.6 micron HPLC column that have inferior resolving power compared to our 1.7
micron one. In later years, several publications indicated potential small-molecule biomarkers for early detection
of bladder cancer; however30–33, to our knowledge, only two papers using a group of more than one-hundred
patients and with external validation have been published so far16,20. Similarly, there are very few reports on the
analysis of urine of patients with BC, considering the division into dierent stages and grades of cancer, as well as
gender and age21,34. ere are no reports published that combine large cohorts of patients and also controls with
ultrahigh performance liquid chromatography combined with ultrahigh resolution mass spectrometry system.
In this work, we report the results of an untargeted analysis of human urine with ultra-high-resolution mass
spectrometry coupled with ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC-UHRMS) with external
validation. is study employed a large number of patients—100 cancer patients and 100 controls. e untar-
geted analysis focused on urine metabolic changes generated by bladder cancer and stratied the disease by
stage, grade, age, and gender. Our study reveals potential urinary BC biomarkers for early detection, screening,
and dierential diagnosis.
Materials and methods
All chemicals were of LCMS- or analytical reagent-grade. Deionized water (18 MΩcm) was produced locally.
LC–MS-grade methanol was bought from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Instrumentation. e untargeted analysis was performed using a Bruker Elute UHPLC system with Hys-
tar 3.3 soware and an ultra-high-resolution mass spectrometer Bruker Impact II (60,000 + resolution version;
Bruker Daltonik GmbH) ESI QTOF-MS with Data Analysis 4.2 (Bruker Daltonik GmbH) and Metaboscape
(ver. 2022b). Metabolite separation was achieved with a gradient of mobile phases using a Waters UPLC column
ACQUITY BEH (C18 silica, 1.7μm particles, 50 × 2.1mm) with a compatible column guard was used for all
analyses. Further details are described in our previous publication35 and supplementary information 1 (sec-
tionS1).
Collection of human urine samples. Urine samples were taken from 100 BC patients at John Paul
II Hospital in Kolbuszowa, Poland (average age 73, white ethnicity). Control group consisted of age and sex
matched patients admitted to the Urology Department for surgery of benign urological conditions including
benign prostatic hyperplasia (BPH), urine stones, phimosis, UPJO (Ureteropelvic Junction Obstruction), and
stress urinary incontinence. Prior to the procedure (day before) each patient, underwent a comprehensive set
of laboratory tests, including a blood count, electrolyte analysis, coagulation panel, creatinine measurement,
glomerular ltration rate (GFR) assessment, urinalysis, lung X-ray, and ultrasound of the cavity as a part of
standard protocol before each surgery. Aer extensive clinical questioning and laboratory testing, all patients
with cancer had transurethral resection of bladder tumor (TURBT). e study was authorized by the University
of Rzeszow’s local Bioethics Committee (Poland, permit number. 2018/04/10) and complied with relevant rules
and legislation. All methods were performed in accordance with the relevant guidelines and regulations. Written
informed consent was obtained from all subjects. All patients who participated in the trial were told about the
3
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
study’s goal and methods, and they completed an informed permission form. Patients hospitalized in the urol-
ogy department for surgical treatment of benign urological diseases include the whole NCs group (urolithiasis,
benign prostate hyperplasia, testicular hydrocele, varicocele, phimosis, ureteropelvic junction stenosis, urinary
incontinence, urethral stricture). Each individual has received at least one abdominal ultrasound to rule out
neoplasms (patients with urolithiasis frequently get a CT scan) and a basic set of lab tests necessary for urologi-
cal surgery to rule out inammation. Patients in the control group received written authorization to give leover
urine for investigation aer being informed about the research program. Each participant had 10ml of urine
collected from them. At room temperature, samples were centrifuged at 3000rpm for 10min. e samples
were then stored at − 80°C until use. e clinical characteristics of the patients are presented in supplementary
information 1, tableS1.
Sample preparation. As detailed in our recent work, medium-to-high polarity metabolites were isolated
from urine samples36. In summary, urine samples were thawed at 4°C and then centrifuged at 12,000 × g for
5min at 4°C. A total of 900µL of acetone was added to 300 µL of supernatants. Aer vortexing for 1min, the
solutions were incubated at room temperature for 20min, followed by 20min at − 20°C, and then centrifuged
at 6000 × g for 5min at 4°C. en, 800µL of supernatants were transferred to a fresh polypropylene tube. e
pellets were resuspended in 500µL of an acetone-H2O (3:1 v/v) combination and vortexed extensively. Samples
were centrifuged at 12,000 × g for 10min at 4°C. e supernatants from the pellet washes were mixed with those
from the rst spin. 260µL of mixed supernatants were vacuum dried in a speedvac-type concentrator, dissolved
in 900 µL of methanol, vortexed, and centrifuged (12,000 × g for 5min at 4°C). A 800µL supernatant volume
was placed into an HPLC vial and put into the Elute autosampler.
Data analysis. In this study, we characterized the metabolic prole of urine from 100 patients with diag-
nosed BC and also from 100 normal control subjects (NCs) to develop potentially discriminant biomarkers for
early, specic, and sensitive detection of this disease using ultra-high-resolution LC–MS. Two datasets from BC
patients and NCs have been created: a training set, which contained 70% of all samples, and a validation set,
which had 30% of all samples. In the training set, samples from a patients with certain stages and grades of BC
made up 80% of all samples for a particular stage and grade of this disease. On the two datasets, urine metabolic
proling was carried out separately. e training data set was used to identify urine diagnostic markers dier-
entiating the control group from cancer, high- and low-grade, pTa and pT1 stage. In turn, the validation set was
used to validate the diagnostic performance of urine metabolite biomarkers independently. In the case of the
analysis of samples from patients with pT2 stage of BC, in dierent age groups, and from women, the number
of samples was insucient to conduct a reliable statistical analysis divided into two independent sets. erefore,
the study was performed for the entire data set. In comparing patients of dierent sex and age, the control group
consisted of people of a given sex and from a specic age group.
Multivariate statistical analysis. For raw data, we have used Metaboscape v.2022b program recom-
mended ltration of recorded features that removes the ones that for given m/z and retention time are not
detected in samples from minimum 10 patients. is amount of patients is correlated with smallest group of given
medical condition. en data were exported and saved in CSV format. Subsequently, the data was imported into
the Metaboanalyst 5.0 online soware37 for further analysis. Within the Metaboanalyst platform, the data was
normalized using log-transformed, auto-scaled, and sum-normalized before analysis. e resulting metabolite
proles were then submitted to unsupervised Principal Component Analysis (PCA). e separation identied in
the 2D and 3D PCA score plots between the BC and control groups was further investigated utilizing supervised
multivariate statistical analysis such as Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA). e
goodness of t (R2Y) and predictive ability of the OPLS-DA models were used to evaluate their quality (Q2). VIP
plots were created to identify the metabolites most substantially responsible for group separation. VIP values
of more than 1.0 were considered promising biomarker candidates. Permutation tests with 2000-fold repetition
were used to assess the correctness of the multivariate statistical models and rule out the possibility that the
observed separation in the OPLS-DA is attributable to chance (P-value < 0.05). e t-test with Mann–Whitney
and Bonferroni correction was used to determine the statistical signicance of metabolite level dierences. Less
than 0.05 P-values and false discovery rates (FDR; q-value) were considered statistically signicant. e diagnos-
tic value of the identied metabolites was evaluated using receiver operating characteristic curve (ROC) stud-
ies and random forest modeling. e metabolites’ performance was calculated using the area under the curve
(AUC), 95% condence interval, specicity, and selectivity. AUC values greater than 0.9 indicate that the model
is highly dependable, AUC values between 0.7 and 0.9 suggest moderate reliability, AUC values between 0.5 and
0.7 indicate low reliability, and AUC 0.5 shows that the model prediction is no better than chance. Only variables
with an AUC greater than 0.70 were deemed meaningful. e training and validation datasets were subjected to
separate multivariate statistical analyses. Chemicals that distinguish between tumor and control urine samples
were chosen via external validation, which involves using two dierent datasets (here referred to as the training
and validation datasets) to validate the performance of a model. e nal collection of possible BC biomark-
ers met all testing and validation data set requirements. Chemometric methods such as 2D PCA, OPLS-DA,
and ROC analysis were also employed to compare and contrast metabolic proles between various grades and
stages of bladder cancer. A metabolic pathway impact study was performed in MetaboAnalyst 5.0 utilizing the
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway library for Homo sapiens38 to discover metabolic
pathways inuenced by bladder cancer. e Small Molecule Pathway Database performed quantitative pathway
enrichment analysis (SMPD). Each aected pathway was identied using statistical P-values, Holm p (P-value
4
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
corrected using the Holm-Bonferroni technique), and FDR (P-value adjusted using the False Discovery Rate),
computed using pathway topology analysis.
Ethical approval. e local Bioethics Committee approved the study protocol at the University of Rzeszow
(Poland) (permission no. 2018/04/10). Written informed consent was obtained from all subjects and/or their
legal guardian(s).
Results
Distinguishing between bladder cancer and control urine samples. In total, 2969m/z features
were detected in each urine sample, with the condition that feature is found in at least nine samples correspond-
ing to the smallest group of cancer subtype. Both subsets’ unsupervised 2D PCA score plots clearly distinguished
between cancer patients and controls. e principal components 1 and 2 (i.e., PC1 and PC2), which accounted
for 22.2% and 10.7%, respectively, provided the best group separation in the training set. In the middle 95% of
the eld of view, just a few outliers were found (Fig.1a). Additionally, in the validation set, PC1 (26.2%) and PC2
(9.4%) showed the best separation between cancer and control urine samples (Fig.S1A, information 1).
To investigate the metabolic dierences between the BC and NC groups, a supervised multivariate OPLS-DA
analysis was performed. e score plot in the training set showed a clear divergence between the two groups
(Fig.1b). e OPLS-DA model was validated using 2000 permutation tests (TableS2, supplementary informa-
tion). ere was good discrimination between the two groups (Q2 = 0.960, R2Y = 0.991, p-value 5E-04 (0/2000)),
revealing signicant dierences in the metabolic proles of cancer urine samples versus control urine samples.
is OPLS-DA model has a high R2Y and Q2, indicating good interpretability and predictability. A similar
tendency to discriminate BC patients and NCs was observed in the validation set’s OPLS-DA model (TableS2),
which was conrmed by the excellent permutation test results (Q2 = 0.918, R2Y = 0.984, p-value 5E-04 (0/2000)).
Volcano plot and PCA biplot of the most signicant metabolite changes comparing cancer and control group
was shown in supplementary information in the FigureS2. e VIP plot generated by the OPLS-DA model was
used to select potential urine bladder cancer biomarkers. en, univariate ROC analysis was performed on both
the training and validation sets to assess the models’ diagnostic ability. e area under the ROC curve (AUC),
an adequate measure of model performance, was utilized as a metric to analyze the biomarkers’ sensitivity and
specicity. Only m/z with an AUC value higher than 0.70 were considered to be relevant by combining the VIP
(> 1.0) and AUC (> 0.7) with the independent t-test results (p-value and FDR from t-test under 0.05), 464 vari-
ables in the training set were chosen as dierential in urine for BC patients and NCs. In turn, 548 variables were
considered signicant in the validation set. Finally, 51m/z features common to both sets were le for which a
Figure1. Metabolomic analysis of BC and NC urine samples in the training set. (a) PCA and (b) OPLS-DA
score plots of tumor (violet) and control (orange) urine samples. (c) e receiver operator characteristic (ROC)
curves. (D–G) e box-and-whisker plots of selected metabolites were observed in the control and BC urine
samples.
5
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
specic chemical compound was assigned (Table1, supplementary information 2). e results showed that in
urine samples, 5 of the previously selected 51 metabolites have a very high AUC value of more than 0.9 and high
parameters of specicity and sensitivity of more than 80 and 81%, respectively (Table1 and S1, supplementary
information 2). e combination of mass features in the validation and training set was a robust discriminator
of control versus bladder cancer urine samples (AUC > 979%), as illustrated in Fig.1c and S1C.
Determination of low‑ and high‑grade bladder cancer and control urine samples. Another
series of PCA and OPLS DA analyses were performed on the training (70 NCs, 30 patients with HG, and 38
patients with LG) and validation (30 NCs, 12 patients with HG, and 17 patients with LG) data sets (Tabe S1) to
see if metabolomics analysis of urine samples could help discriminate between dierent grades of BC. Patients
with PLUMP were excluded from this analysis due to their small number.
In both the training and validation sets, PCA and OPLS-DA scores plots showed good separation between
control groups and cancer groups with dierent grades of tumors (LG vs. NCs and HG vs. NCs) (Fig.2a–d,
S3). e quality factors for these models were Q2 > 0.879 and R2Y > 0.983, and the P-values from permutation
tests (n = 2000) were less than 5E−4 (TableS3), which means that the metabolites proles of these two groups
could not be more dierent. But in the PCA scores plot, we didn’t see a big dierence between the LG and HG
BC patients (data not shown). In the LG BC vs. NCs OPLS-DA model, 26 identied chemical compounds were
considered signicant (VIP > 1, P-value 0.05) in both the training set and the validation set (TableS2, supple-
mentary information 2).
Analysis of HG BC vs. NCs in the training and validation sets of the OPLS-DA model showed that 63 com-
monly identied compounds were important in separating the two groups (TableS3, supplementary information
2). Based on the results of univariate ROC curve analyses, it was determined that these models have satisfactory
diagnostic performance. Two of the twenty-six metabolites in the LG versus NCs model and thirteen of the
sixty-three in the HG vs. NCs model had AUC values higher than 0.90 with sensitivity and specicity of more
than 80 and 87%, respectively (Table1). Selected metabolites most dierentiating dierent grades of BC and
NCs are shown in Fig.2e–h.
Determination of dierent stages of bladder cancer and control urine samples. To dierentiate
between the various stages of bladder cancer, PCA and OPLS-DA models were developed. e 68 urine samples
Table 1. Dierential metabolites for discrimination between BC patients and NCs (P-value and FDR < 0.001;
VIP > 1; FC < 0.5 and > 2; AUC > 0.9). a Experimental monoisotopic mass of ion; bVIP scores derived from
OPLS-DA model; cfold change between cancer and control serum calculated from the abundance mean values
for each group – cancer-to-normal ratio; dROC curve analysis for individual biomarkers; ethe metabolites
identied by high precursor mass accuracy; fthe metabolites identied by matching retention time; gthe
metabolites identied by matching isotopic pattern; hthe metabolites identied by matching MS/MS fragment
spectra; AUC: area under the curve; FC: fold change; FDR: false discovery rate; m/z: mass-to-charge ratio; RT:
retention time; Sens.: Sensitivity; Spec.: Specicity; VIP: variable inuence on projection.
No. Name Formula m/zaRT [min] VIPbFCcP-value FDR AUC Spec. [%]dSens. [%]d
1 Oleamidee,g,h
Cancer versus control
C18H35NO 282.2790 5.08 1.70 3.00 2.34E−20 1.73E−18 0.953 90 89
2Indoleacetic acide,f,g C10H9NO2217.0974 2.02 2.08 0.15 1.14E−19 5.43E−18 0.944 90 90
3Isostearic acide,g,h C18H36O2285.2785 0.20 1.95 0.16 1.28E−19 5.99E-18 0.944 86 89
4N-Alpha-acetyllysinee,f,g C8H16N2O3268.1056 0.14 1.96 14.89 4.17E−17 9.94E-16 0.912 80 90
5Azelaic acide,f,g,h C9H16O4171.1014 2.54 1.94 0.35 2.97E−16 6.01E−15 0.900 87 81
6Indoleacetic acide,f,g LG versus control C10H9NO2217.0974 2.02 2.12 0.18 1.16E−13 4.19E−12 0.934 87 96
7Isostearic acide,g,h C18H36O2285.2785 0.20 1.97 0.18 4.91E−13 1.50E−11 0.923 89 82
8Isostearic acide,g,h
HG versus control
C18H36O2285.2785 0.20 1.94 0.13 1.64E−13 1.43E−11 0.967 97 87
9 Oleamidee,g,h C18H35NO 282.2790 5.08 1.73 4.65 2.88E−13 1.85E−11 0.962 96 87
10 Indoleacetic acide,f,g C10H9NO2217.0974 2.02 2.12 0.12 5.02E−13 2.75E−11 0.958 96 93
11 2-Furoylglycinee,f,g,h C7H7NO4170.0447 1.60 2.00 0.11 7.81E−13 3.66E−11 0.954 96 87
12 Azelaic acide,f,g,h C9H16O4171.1014 2.54 1.87 0.27 1.87E−12 7.16E−11 0.946 90 87
13 Cis,cis-Muconic acide,f,h C6H6O4125.0232 1.53 1.97 0.09 3.03E−12 1.08E−10 0.942 91 87
14 Phenylglyoxylic acide,f,g C8H6O3151.0386 1.85 1.89 0.18 5.16E−12 1.62E−10 0.937 96 83
15 N-Alpha-acetyllysinee,f,g C8H16N2O3268.1056 0.14 1.85 15.22 1.47E−11 3.85E−10 0.928 100 80
16 Methylmalonic acideC4H6O4119.0344 0.03 2.12 0.13 1.55E−11 3.95E−10 0.927 93 90
17 3,4-Dihydroxymandelic
acideC8H8O5226.0709 1.85 1.79 0.19 4.10E−11 8.36E−10 0.918 90 83
18 N-Acetylserotonine,f C12H14N2O2175.1227 1.75 1.81 0.21 8.73E−11 1.57E−09 0.911 87 90
19 3-Hydroxy-4-methoxycin-
namic aicdeC10H10O4195.0654 1.79 1.87 0.15 1.06E−10 1.87E−09 0.909 86 87
20 Tiglylglycinee,f C7H11NO3199.1076 1.56 1.69 0.32 1.66E−10 2.74E−09 0.905 81 87
6
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
from patients with noninvasive papillary carcinomas (pTa) were divided into training (70 NCs, 47 patients with
pTa) and validation (30 NCs, 21 patients with pTa) sets. e 19 urine samples from patients with the pT1 stage
of BC were divided into training (70 NCs, 15 patients with pT1) and validation (30 NCs, 5 patients with pT1)
Figure2. Metabolomic analysis of HG/LG BC and NCs of urine samples in the training set. (a) PCA and
(b) OPLS-DA score plots of HG BC (violet) and control (orange) urine samples. (c) PCA and (d) OPLS-DA
score plots of LG BC (green) and control (orange) urine samples. (e, h) e box-and-whisker plots of selected
metabolites were observed in the control, HG, and LG BC urine samples.
7
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
sets. In the case of the pT2 stage of BC, the analysis was performed without dividing it into two sets (30 NCs, 12
patients with pT2). e PCA and OPLS-DA score plots demonstrated a decent separation between NCs and the
various stages of BC (pTa vs. NCs, pT1 vs. NCs, and pT2 vs. NCs, Fig.3a-f).
Quality factors for these models were Q2 > 0.836 and R2Y > 0.985, and P-values derived from permutation tests
(n = 2000) were less than 5E-4 (TableS2), suggesting very strong discrimination of metabolite proles between
these groups. e performance of three models in dierentiating between pTa, pT1, and pT2 bladder cancer
stages and NCs was then evaluated using ROC curve analysis. Based on the cut-o criteria (FC > 2 < 0.5, VIP > 1;
AUC > 0.7, P-value and FDR < 0.05), nally, 19, 68, and 81 chemical compounds appeared to be most relevant
for sample distinction between pTa BC vs. NCs, pT1 BC vs. NCs, and pT2 BC vs. NCs, respectively (TableS4-S6,
supplementary information 2). Comparing the three cancer stage groups (pT1 versus pTa versus pT2) revealed
Figure3. Metabolomic analysis of pTa/pT1/pT2 BC and NCs of urine samples in the training set. (a) PCA
and (b) OPLS-DA score plots of pTa BC (blue) and control (orange) urine samples. (c) PCA and (d) OPLS-DA
score plots of pT1 BC (violet) and control (orange) urine samples. (e) PCA and (f) OPLS-DA score plots of pT2
BC (green) and control (orange) urine samples. (g–k) e box-and-whisker plots of selected metabolites were
observed in control, pTa, pT1, and pT2 BC urine samples.
8
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
no statistically signicant dierences (data not shown). Selected metabolites most dierentiating dierent stages
of BC and NCs are shown in Fig.3g–k.
Sex‑related dierentiation of metabolomic proles. e dierentiation of metabolites in urine
extracts from patients of dierent sexes was studied. e control group consisted of people matched to a given
sex. e comparison of the male BC patients with the male control group was performed with a division into the
training (55 male BC, 51 male control) and validation (26 male BC, 19 male control) sets. e group of female
patients was compared on the whole data set (19 female BC, 30 female control).
In both the training and validation sets, PCA and OPLS-DA score plots revealed good discrimination between
separate control and cancer groups of dierent sex (Fig.4a–d).
e quality factors for those models amounted to Q2 > 0.907 and R2Y > 0.986, and the P-values derived from
the permutation tests indicated perfect discrimination of metabolite proles between those groups. However,
we did not nd a signicant dierence between the two groups when comparing the male and female patients
using the PCA scores plot (data not shown).
e performance of two models in dierentiating between male and female BC patients and male and female
NCs was then evaluated using ROC curve analysis. Based on the cut-o criteria (FC > 2 < 0.5, VIP > 1; AUC > 0.7,
P-value and FDR < 0.05), nally, 79 and 48 chemical compounds appeared to be most relevant for sample distinc-
tion between male BC vs. male NCs, and female BC versus female NCs, respectively (TableS7-S8, supplementary
information 2). Selected metabolites that dierentiate BC patients with dierent gender from NCs are shown
in Fig.4e–h.
Age‑related dierentiation of metabolomic proles. e dierence in metabolites in urine extracts
from patients of various ages was examined. e control group was made up of people of the same age. e entire
set of LC–MS data from urine samples from BC and NCs patients was divided into three age groups. e rst
group consisted of 11 samples from BC patients aged 40 to 60 and 49 controls of the same age. e second group
included 24 samples from BC patients aged 40 to 60 and 13 controls of the same age. e third group consisted
of 65 samples from BC patients aged 40 to 60 and 13 controls of the same age. PCA and OPLS-DA score plots
indicated strong age-specic identication of distinct NCs and BC groups (Fig.5a–f).
e quality factors for those models amounted to Q2 > 0.867 and R2Y > 0.990, and the P-values derived from
the permutation tests indicated perfect discrimination of metabolite proles between those groups. e per-
formance of three models in dierentiating between BC patients of dierent ages and NCs was then evaluated
using ROC curve analysis. Based on the cut-o criteria (FC > 2 < 0.5, VIP > 1; AUC > 0.7, P-value and FDR < 0.05),
nally, 65, 55, and 66 chemical compounds appeared to be most relevant for sample distinction between BC
patients aged 40 to 60 vs. NCs aged 40 to 60, BC patients aged 61 to 70 versus NCs aged 61 to 70 and BC patients
aged 71 to 90 vs. NCs aged 71 to 90 (TableS9–S11, supplementary information 2). Selected metabolites that
dierentiate BC patients with dierent age from NCs are shown in Fig.5g–j.
Pathway analysis of potential biomarkers. MetaboAnalyst 5.0 was used to perform a metabolic path-
way impact analysis to identify the most relevant pathways involved in the observed changes in urine metabolite
levels. Pathway and quantitative pathway enrichment analyses were performed on 116 metabolites identied
in the UHPLC-UHRMS analysis. A total of 100 compounds were discovered to be relevant to human metabo-
lism. When comparing BC to NCs, four metabolic pathways were signicantly impacted (P-value): tryptophan
metabolism, pantothenate and CoA biosynthesis, tyrosine metabolism and vitamin B6 metabolism. Figure6a
and TableS2 show the results of the pathway impact analysis (supplementary information 1).
We conducted a quantitative enrichment analysis with the MetaboAnalyst 5.0 pathway enrichment module
and its associated Small Molecule Pathway Database (SMPDB) to expand the metabolomic study of bladder
cancer-related pathways. Figure6b and TableS3 show two signicant pathways associated with bladder cancer:
tryptophan metabolism, and vitamin B6 metabolism.
Discussion
Over the last ten years, metabolomics studies have revealed potentially valuable information regarding the meta-
bolic proles of individuals aicted with various diseases, including cancer, and possible disease progression or
recurrence markers. Rapidly proliferating cancer cells have the potential to change their metabolism to suit their
increased energy demands. Monitoring variations in the concentrations of various metabolites in cancer cells
or bodily uids could be a source of novel cancer biomarkers. Several studies have demonstrated the signicant
potential of metabolomic markers in diagnosing multiple cancers and the comprehension of the mechanisms
behind cancer onset and progression39.
is investigation compare changes in urine metabolite levels between 100 patients with BC and 100 NCs.
e 51 metabolites that distinguished these two groups the most were identied. A large group of compounds
dierentiating the NCs group from the BC patients (tableS1, supplementary information 1) was lipids and its
derivatives.Lipids serve as long-term energy storage and are the fundamental building blocks of all cell mem-
branes. Furthermore, lipids play essential roles in living organisms, including nerve impulse transmission, hor-
mone production and regulation, cushioning vital organs, intracellular signal transmission, and cell transporting
systems. Lipid metabolism is involved in several processes related to cancer cells. Numerous studies over the last
decade have shown that lipids and metabolites associated with lipid metabolism may be potential markers in
human cancers, including bladder cancer40. We found that the urine content of 10 lipids, including four medium-
chain fatty acids (2-hydroxyaproic acid, sebacic acid, azelaic acid, cis,cis-muconic acid), three acylcarnitines
(3-methylglutarylcarnitine, isovalerylcarnitine, L-acetylcarnitine), two long-chain fatty acids (isostearic acid,
9
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
palmitic acid) and one hydroxy fatty acid(3-hydroxymethylglutaric acid) was signicantly higher in the urine of
NCs than in the BC subjects. e opposite trend was observed for oleamide (Fig.1d), which was found in much
higher concentrations in the urine of BC patients compared to the NCs group, and which turned out to be the
Figure4. Metabolomic analysis of female/male BC and NCs of urine samples. (a) PCA and (b) OPLS-DA
score plots of female BC (violet) and control female (orange) urine samples in the training set. (c) PCA and (d)
OPLS-DA score plots of male BC (blue) and control male (green) urine samples. (e–h). e box-and-whisker
plots of selected metabolites were observed in control, male, and female BC urine samples.
10
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
most distinguishing compound between these two groups. Of all the lipids recognized as the most dierentiating,
oleamide, isostearic acid, and azelaic acid with AUC > 0.9 were the most important.
Oleamide is a member of the fatty amides class of organic compounds. It is an endogenous chemical com-
pound found naturally in blood and urine. is compound has been demonstrated to have a wide variety of
neuropharmacological eects on many neurochemical systems, and it is recognized as a fatty acid amide that
induces sleep41. Oleamide is an agonist of cannabinoid 1 and 2 (CB1 and CB2) receptors that promote cell growth
and migration via adhesion and/or ionic signals at Gap junctions. Recent studies have shown that oleamide
Figure5. Metabolomic analysis of female/male BC and NCs of urine samples. (a) PCA and (b) OPLS-DA
score plots of BC patients aged 40 to 60 (violet) and the control group aged 40 to 60 (orange) of urine samples.
(c) PCA and (d) OPLS-DA score plots of BC patients aged 61 to 70 (green) and the control group aged 61 to 70
(orange) of urine samples. (e) PCA and (b) OPLS-DA score plots of BC patients aged 71 to 90 (blue) and the
control group aged 71 to 90 (orange) of urine samples. (g–j) e box-and-whisker plots of selected metabolites
were observed in control BC urine samples from people of dierent ages.
11
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
induces cell death in glioblastoma RG2 cells42 and inhibits Caco-2 colon cancer cell proliferation43. Moreover,
it was also demonstrated that oleamide increases calcium ions in T24 bladder cancer cell lines, suggesting that
this compound may alter the cellular function in the urinary system44. Oleamide has not yet been found as a
possible biomarker for BC. Yet, an earlier study has revealed that the content of oleamide in the urine of patients
with kidney and laryngeal cancer is greater than that of healthy people serving as controls45,46 and in the serum
of patients with colorectal cancer47.
Among the lipids most dierentiating cancer and the control group, there were also isostearic (Fig.1f) and
azelaic acids (Fig.1h). Azelaic acid is a saturated nine-carbon dicarboxylic acid generated from fatty acid oxida-
tion that suppresses neutrophil reactive oxygen species formation. Azelaic acid has been identied as a potential
biomarker for colorectal cancer, with signicantly lower levels in the urine of patients whit this tumor compared
to healthy controls48. Similarly, in our studies, the urine level of azelaic acid was more decient in BC patients
than NCs (Fig.1h).
Indoleacetic acid (IAA) was the second compound, aer oleamide, to dierentiate the BC group from the
NCs group (Fig.1e). IAA is a breakdown product of tryptophan metabolism in mammalian tissues that may be
produced by the decarboxylation of tryptamine or the oxidative deamination of tryptophan. Some studies indi-
cated an elevated level of IAA in the urine of patients with cervical cancer49 compared to controls, which may be
associated with increased secretion of this compound by tumor tissues. IAA was also detected at a high level in
serum samples of BC patients compared to healthy controls50. Our research shows a signicantly lower amount
of IAA in BC patients’ urine than NCs. Similar results were obtained in analyzing urinary metabolites in patients
with breast cancer51. Moreover, indoleacetic acid is a metabolite of gut bacteria. It is possible that the changes in
this metabolite were due to changes in the gut microbiome in BC patients, as previously suggested by Tan etal.50.
N-Alpha-acetyllysine is involved in DNA transcriptional activities, including the acetylation of lysine cata-
lyzed by histone acetyltransferase enzymes by adding acetyl groups from acetyl-CoA onto lysine residues histones
and nonhistone proteins. In this investigation, the level of N-alpha-acetyllysine in urine was higher in the BC
group than in NCs individuals (Fig.1g). is aligns with previous studies conducted by Yumba Mpanga and
coworkers, 58, who identied and quantied this compound in the urine of patients with BC. Interestingly,
acetyllysine was among the most statistically signicant metabolites discriminating against patients with prostate
cancer (PC) and healthy individuals at high-signicantly lower concentrations in urine from PCa patients52.
To implement the proper treatment regimens for BC patients, it is required to clearly and adequately dene the
stage and grade of this malignancy and indicate the neoplasm. In total, 51 dierential metabolites were identied
as a potential markers for discriminating between LG BC patients and NCs. Indoleacetic acid (specicity—96%,
sensitivity—93%) and isostearic acid (specicity—97%, sensitivity—87%) were found to be the most dierentiat-
ing compounds in this model, with AUC > 0.9. Fiy-nine dierential metabolites were identied as a potential
marker for discriminating between HG BC patients and NCs. Among these metabolites, 5 had tremendous
discriminant signicance with an AUC greater than 0.95, including isostearic acid, oleamide, indoleacetic acid,
2-furoylglycine, and azelaic acid. Apart from oleamide, other compounds were identied in signicantly lower
Figure6. Analysis of the topology of selected statistically signicant metabolites in BC. (a) Pathway analysis
based on KEGG, with bubble area corresponding to the impact of each pathway and color representing
signicance from red to white, from greatest to least. (1) tryptophan metabolism; (2) pantothenate and CoA
biosynthesis; (3) tyrosine metabolism (4) vitamin B6 metabolism (5) citrate cycle (TCA cycle); (6) beta-alanine
metabolism; (b) Quantitative enrichment analysis based on SMPDB.
12
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
levels in the urine of HG BC patients compared to NCs. 2-Furoylglycine belongs to the N-acyl-alpha amino acids
class and is a product of fatty acid catabolism linked to mitochondrial fatty acid beta-oxidation. Earlier urine
analysis of prostate cancer patients also showed signicantly decreased levels of this compound in the cancer
group compared to controls53.
Our study shows that a urine-based metabolite prole could accurately discriminate dierent stages of BC
(pTa, pT1, and pT2) and NCs (Table2). In the urine of patients with pTa, pT1, and pT2 stages of BC, we identied
22 the most dierentiating compounds (with AUC > 0.91). One of the compounds that determined stages of BC
from NCs to the greatest extent was benzaldehyde, which was identied in a much higher amount in the urine
of patients from the control group. Benzaldehyde is a simple alkane whose levels rise during inammation and
oxidative stress, both of which are hallmarks of cancer54. In previous studies benzaldehyde was found signicantly
increased in BC cells lines55. Aldehydes are established indicators of oxidative stress and tissue damage, however
in our study this does not explain the substantially lower quantities found in BC patients’ urine.
Many studies have found that clinical conditions, genetic background, race, age, sex, lifestyle, diet, and medi-
cines strongly impact the urine metabolic prole32,56. Age and gender are signicant determinants that inuence
the urine metabolome, according to inter-individual variance analyses. Knowing the specic dierences in
metabolites linked with age and gender can give a foundation for comparative studies as well as insight into the
metabolic systems of a healthy body. In literature there are evidences to suggest that sex-related dierentiation can
inuence metabolomic proles. Several studies have demonstrated dierences in metabolomic proles between
males and females in various physiological and pathological conditions57. For example, a study published by
Fan etal.58 analyzed the urine metabolome of healthy individuals and found signicant sex-related dierences
in metabolic proles. e study identied several metabolites that showed sex-specic variations, suggesting
inherent metabolic distinctions between males and females. Another example of report of this kind was published
recently59. e researchers identied sex-specic metabolic signatures and found that certain metabolites were
signicantly dierent between males and females, indicating potential sex-related metabolic variations. Further-
more, sex-related dierences in metabolomic proles have been observed in various diseases and conditions,
including cardiovascular diseases, cancer, diabetes, and obesity. ese dierences may arise from variations in
hormonal levels, genetic factors, and sex-specic physiological processes. However, sex-related dierentiation of
Table 2. Dierential metabolites for discrimination between pTa, pT1 and pT2 BC patients and NCs
(P-value < 0.05; FDR < 0.05; VIP > 1; FC < 0.5 and > 2; AUC > 0.91). a Experimental monoisotopic mass of ion;
bfold change between cancer and control serum calculated from the abundance mean values for each group
– cancer-to-normal ratio; cROC curve analysis for individual biomarkers; dthe metabolites identied by high
precursor mass accuracy; ethe metabolites identied by matching retention time; fthe metabolites identied by
matching isotopic pattern; gthe metabolites identied by matching MS/MS fragment spectra; FC: fold change;
m/z: mass-to-charge ratio; RT: retention time; Sens.: Sensitivity; Spec.: Specicity.
No Metabolites Formula m/zaRT [min]
pTa versus control pT1 versus control pT2 versus control
FCbSpec. [%]cSens. [%]cFCbSpec. [%]cSens. [%]cFCbSpec. [%]cSens. [%]c
12,5-Furandicarboxylic
acidd,e,g C6H4O5157.0130 1.28 – – – 0.19 83 100 – – –
2 2-Furoylglycined,e,f,g C7H7NO4170.0447 1.60 – – – 0.07 97 87 0.13 93 92
33,4-Dihydroxymandelic
aciddC8H8O5226.0709 1.85 – – – - – – 0.20 90 83
4Azelaic acidd,e,f,g C9H16O4171.1014 2.54 – – – 0.26 79 93 0.30 93 100
5 BenzaldehydedC7H6O 107.0490 3.30 0.29 100 94 0.32 100 87 0.27 87 92
6CholinedC5H14NO 143.0702 1.81 – – – 0.19 81 87 – – –
7Cis,cis-Muconic acidd,e,g C6H6O4125.0232 1.53 – – – 0.09 91 93 0.08 83 92
8Indoleacetic acidd,e,f C10H9NO2217.0974 2.02 0.18 87 87 0.09 96 93 0.08 90 100
9Isostearic acidd,f,g C18H36O2285.2785 0.20 0.14 87 87 0.20 87 87 0.47 93 92
10 Methylmalonic aciddC4H6O4119.0344 0.03 – – – 0.19 94 87 – – –
11 Mevalonic aciddC6H12O4190.1069 2.03 – – – - – – 0.28 90 83
12 N-Acetylserotonind,e C12H14N2O2175.1227 1.75 – – – 0.17 90 93 0.18 97 83
13 N-Alpha-acetyllysined,e,f C8H16N2O3268.1056 0.14 – – – 14.06 87 87 – – –
14 Oleamided,f,g C18H35NO 282.2790 5.08 – – – 6.99 96 100 2.14 83 83
15 Palmitamided,f,g C16H33NO 256.2633 5.02 – – – 4.04 93 93 – – –
16 Pantothenic acidd,f,g C9H17NO5220.1179 1.68 – – – – – – 0.44 90 92
17 Phenylacetylglycined,e,g C10H11NO3194.0811 2.19 – – – – – – 0.24 83 83
18 Phenylglyoxylic acidd,e,f C8H6O3151.0387 1.85 – – – – – – 0.15 90 92
19 Picolinuric acidd,f,g C8H8N2O3181.0607 1.88 – – – 0.40 90 80 – – –
20 Sebacic acidd,e,f C10H18O4203.1275 2.22 – – – 0.28 81 93 0.38 83 92
21 Succinic acide,f C4H6O4119.0344 0.26 – – – 0.46 94 80 – – –
22 Vanillic acidd,e,g C8H8O4169.0491 1.79 – – – – – – 0.27 87 92
13
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
metabolomic proles is a complex phenomenon inuenced by multiple factors, and further research is needed
to fully understand its underlying mechanisms and implications especially in BC.
Our research further explored the detailed urinary metabolites associated with BC patients of dierent sex. As
presented in TableS3 (supplementary information 1), we have identied 19 of the most dierentiating metabolites
(AUC > 0.9) that most signicantly determine the urine of males and females with BC from NCs. One of the
compounds that the most dierentiate males from the control group is tryptophan, which was found in signi-
cantly more signicant amounts in urine samples from males with BC patients compared to females with BC and
NCs. Tryptophan is involved in several mechanisms, including synthesizing biogenic amines such as serotonin,
melatonin, and tryptamine. It contributes to the formation of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), an
essential coenzyme for energy metabolism in animals (such as the citrate cycle). Prior research suggested that
tryptophan metabolism may inuence human lifespan regulation.
Tryptophan metabolism has been extensively studied in relation to bladder cancer, and its signicance has
been consistently reported in the literature60. Previous studies have observed signicant increases in tryptophan
levels in urine, serum, and tissue samples from bladder cancer patients compared to control groups18,61–63. Sex-
related dierences have been identied in the metabolism of tryptophan, suggesting a potential link between sex
hormones and tryptophan-related pathways in the context of bladder cancer32,61. e disruption of tryptophan
metabolism in bladder cancer patients involves various mechanisms aecting enzymes and pathways. One expla-
nation is the increased degradation of tryptophan. Bladder cancer cells may upregulate enzymes like tryptophan
2,3-dioxygenase (TDO) or indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), leading to heightened tryptophan degradation.
is depletion reduces the availability of tryptophan for vital cellular functions64. Additionally, the activation of
the kynurenine pathway was implicated. In bladder cancer, this pathway can become activated, resulting in the
production of immunosuppressive and tumor-promoting metabolites like kynurenine, 3-hydroxykynurenine,
and kynurenic acid65. Alterations in enzyme expression also contribute to tryptophan metabolism disruption.
Changes in the levels of enzymes involved in tryptophan metabolism, such as tryptophan hydroxylase, kynure-
nine aminotransferases, and kynureninase, can impact the conversion of tryptophan into downstream metabo-
lites, leading to metabolic dysregulation66. Immune cells like tumor-associated macrophages or regulatory T
cells can stimulate the expression of IDO or TDO, resulting in tryptophan depletion and immune evasion67.
ese various mechanisms collectively contribute to the disruption of tryptophan metabolism in bladder cancer,
highlighting the complexity of its involvement in the disease.
In conclusion, we show that ultra-high-resolution mass spectrometry is an eective method for character-
izing urine metabolome variations in BC. We have indicated several dozen metabolites that have the potential to
distinguish urine from BC patients from the urine of healthy volunteers, considering the division into dierent
grades and stages of BC cancer as well as gender and age. To date, there is no published research indicating the
specic combinations of metabolites like these proposed by our study that could potentially serve as important
markers for early detection of BC. Furthermore, it was crucial to consider factors such as the stage and grade of
malignancy, as well as the inuence of sex and age, which can further contribute to the complexity of identifying
relevant metabolomic signatures in BC. Future investigations are needed to explore these potential associations
and provide a deeper understanding of the intricate interplay between metabolites, disease characteristics, and
individual factors in the context of BC. Our results have the potential to help develop simple, non-invasive
specic, and sensitive diagnostic tests to detect dierent stages and grades of BC, as well as to monitor disease
recurrence.
Data availability
e corresponding author’s data supporting this study’s ndings are available upon reasonable request.
Received: 24 March 2023; Accepted: 12 June 2023
References
1. Bray, F. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185
countries. CA Cancer J. Clin. 68, 394–424 (2018).
2. Li, M. et al. Recent progress in biosensors for detection of tumor biomarkers. Molecules 27, 7327 (2022).
3. Steinestel, K. et al. Detection of urinary molecular marker test in urothelial cell carcinoma: A review of methods and accuracy.
Diagnostics 12, 2696 (2022).
4. Di Meo, N. A. et al. Metabolomic approaches for detection and identication of biomarkers and altered pathways in bladder cancer.
Int. J. Mol. Sci. 23, 4173 (2022).
5. Ng, K., Stenzl, A., Sharma, A. & Vasdev, N. Urinary biomarkers in bladder cancer: A review of the current landscape and future
directions. Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. 39, 41–51 (2021).
6. Lee, H. H. & Ham, W. S. Perioperative immunotherapy in muscle-invasive bladder cancer. Transl. Cancer Res. 9, 6546–6553 (2020).
7. Petrella, G., Ciufolini, G., Vago, R. & Cicero, D. O. Urinary metabolic markers of bladder cancer: A reection of the tumor or the
response of the body?. Metabolites 11, 756 (2021).
8. Yang, Q. et al. Metabolomics biotechnology, applications, and future trends: A systematic review. RSC Adv. 9, 37245–37257 (2019).
9. Raja, G., Jung, Y., Jung, S. H. & Kim, T. J. 1H-NMR-based metabolomics for cancer targeting and metabolic engineering –A review.
Process. Biochem. 99, 112–122 (2020).
10. Liu, X. et al. LC-MS-based plasma metabolomics and lipidomics analyses for dierential diagnosis of bladder cancer and renal
cell carcinoma. Front. Oncol. 10, 717 (2020).
11. Pan, Z. & Raery, D. Comparing and combining NMR spectroscopy and mass spectrometry in metabolomics. Anal. Bioanal.
Chem. 387, 525–527 (2007).
12. Batista, R. et al. Biomarkers for bladder cancer diagnosis and surveillance: A comprehensive review. Diagnostics 10, 39 (2020).
13. Lokeshwar, S. D. et al. Molecular oncology of bladder cancer from inception to modern perspective. Cancers 14, 2578 (2022).
14. Soorojebally, Y. et al. Urinary biomarkers for bladder cancer diagnosis and NMIBC follow-up: A systematic review. World J. Urol.
41, 345–359 (2023).
14
Vol:.(1234567890)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
15. Rasteiro, A. M., Sá e Lemos, E., Oliveira, P. A. & Gil da Costa, R. M. Molecular markers in urinary bladder cancer: Applications
for diagnosis, prognosis and therapy. Vet. Sci. 9, 107 (2022).
16. Oto, J. et al. LC–MS metabolomics of urine reveals distinct proles for non-muscle-invasive and muscle-invasive bladder cancer.
World J. Urol. 40, 2387–2398 (2022).
17. Loras, A. et al. Integrative metabolomic and transcriptomic analysis for the study of bladder cancer. Cancers 11, 686 (2019).
18. Wittmann, B. M. et al. Bladder cancer biomarker discovery using global metabolomic proling of urine. PLoS ONE 9, e115870
(2014).
19. Peng, J., Chen, Y. T., Chen, C. L. & Li, L. Development of a universal metabolome-standard method for long-term LC-MS metabo-
lome proling and its application for bladder cancer urine-metabolite- biomarker discovery. Anal. Chem. 86, 6540–6547 (2014).
20. Shao, C. H. et al. Metabolite marker discovery for the detection of bladder cancer by comparative metabolomics. Oncotarget 8,
38802–38810 (2017).
21. Cheng, X. et al. Metabolomics of non-muscle invasive bladder cancer: Biomarkers for early detection of bladder cancer. Front.
Oncol. 8, 1–11 (2018).
22. Zhou, Y. et al. Discovery and validation of potential urinary biomarkers for bladder cancer diagnosis using a pseudotargeted
GC-MS metabolomics method. Oncotarget 8, 20719–20728 (2017).
23. Lett, L. et al. Investigation of urinary volatile organic compounds as novel diagnostic and surveillance biomarkers of bladder
cancer. Br. J. Cancer 127, 329–336 (2022).
24. Issaq, H. J. et al. Detection of bladder cancer in human urine by metabolomic proling using high performance liquid chroma-
tography/mass spectrometry. J. Urol. 179, 2422–2426 (2008).
25. Huang, Z. et al. Bladder cancer determination via two urinary metabolites: A biomarker pattern approach. Mol. Cell. Proteomics
10, M111.007922 (2011).
26. Putluri, N. et al. Metabolomic proling reveals potential markers and bioprocesses altered in bladder cancer progression. Cancer
Res. 71, 7376–7386 (2011).
27. Huang, Z. et al. Holistic metabonomic proling of urine aords potential early diagnosis for bladder and kidney cancers. Metabo-
lomics 9, 119–129 (2013).
28. Alberice, J. V. et al. Searching for urine biomarkers of bladder cancer recurrence using a liquid chromatography-mass spectrometry
and capillary electrophoresis-mass spectrometry metabolomics approach. J. Chromatogr. A 1318, 163–170 (2013).
29. Jin, X. et al. Diagnosis of bladder cancer and prediction of survival by urinary metabolomics. Oncotarget 5, 1635–1645 (2014).
30. Li, J. et al. Bladder cancer biomarker screening based on non-targeted urine metabolomics. Int. Urol. Nephrol. 54, 23–29 (2021).
31. Plyushchenko, I. V. et al. Omics untargeted key script: R-based soware toolbox for untargeted metabolomics with bladder cancer
biomarkers discovery case study. J. Proteome Res. https:// doi. org/ 10. 1021/ acs. jprot eome. 1c003 92 (2021).
32. Liu, X. et al. Investigation of the urinary metabolic variations and the application in bladder cancer biomarker discovery. Int. J.
Cancer 143, 408–418 (2018).
33. Shen, C. et al. Developing urinary metabolomic signatures as early bladder cancer diagnostic markers. OMICS 19, 1–11 (2015).
34. Łuczykowski, K. et al. Metabolic evaluation of urine from patients diagnosed with high grade (HG) bladder cancer by SPME-LC-
MS method. Molecules 26, 2194 (2021).
35. Nizioł, J. et al. Untargeted ultra-high-resolution mass spectrometry metabolomic proling of blood serum in bladder cancer. Sci.
Rep. 12, 1–13 (2022).
36. Nizioł, J. et al. Nuclear magnetic resonance and surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-based metabolome
proling of urine samples from kidney cancer patients. J. Pharm. Biomed. Anal. 193, 113752 (2021).
37. Pang, Z. et al. MetaboAnalyst 5.0: Narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Res. 49, W388–
W396 (2021).
38. Ho, S. Y., Phua, K., Wong, L. & Bin Goh, W. W. Extensions of the external validation for checking learned model interpretability
and generalizability. Patterns 1, 100129 (2020).
39. Han, J., Li, Q., Chen, Y. & Yang, Y. Recent metabolomics analysis in tumor metabolism reprogramming. Front. Mol. Biosci. 8,
763902 (2021).
40. Besiroglu, H. Lipid metabolism proling and bladder cancer. Metabolomics (Los Angel) 5, 1–4 (2015).
41. Cravatt, B. F. et al. Chemical characterization of a family of brain lipids that induce sleep. Science 268, 1506–1509 (1995).
42. Torres-Román, A. L. et al. Oleamide induces cell death in glioblastoma RG2 cells by a cannabinoid receptor-independent mecha-
nism. Neurotox. Res. 38, 941–956 (2020).
43. Han, J., Park, Y., Kim, E. J., Jin, H. & Jun, J.-G. Isolation and identication of oleamide as a growth inhibitory compound from the
medium conditioned by colon cancer cells treated with conjugated linoleic acid. Bull. Korean Chem. Soc 23, 1373 (2002).
44. Lo, Y. K. et al. Eect of oleamide on Ca2+ signaling in human bladder cancer cells. Biochem. Pharmacol. 62, 1363–1369 (2001).
45. Chen, J. et al. Urinary metabolomics for discovering metabolic biomarkers of laryngeal cancer using UPLC-QTOF/MS. J. Pharm.
Biomed. Anal. 167, 83–89 (2019).
46. Arendowski, A., Ossoliński, K., Nizioł, J. & Ruman, T. Screening of urinary renal cancer metabolic biomarkers with gold nano-
particles-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Anal. Sci. 36, 1521–1527 (2020).
47. Ni, Y., Xie, G. & Jia, W. Metabonomics of human colorectal cancer: New approaches for early diagnosis and biomarker discovery.
J. Proteome Res. 13, 3857–3870 (2014).
48. Zhu, C. et al. Distinct urinary metabolic biomarkers of human colorectal cancer. Dis. Mark. https:// doi. org/ 10. 1155/ 2022/ 17581
13 (2022).
49. Liang, Q., Yu, Q., Wu, H., Zhu, Y.-Z. & Zhang, A.-H. Metabolite ngerprint analysis of cervical cancer using LC-QTOF/MS and
multivariate data analysis. Anal. Methods 6, 3937–3942 (2014).
50. Tan, G. et al. ree serum metabolite signatures for diagnosing low-grade and high-grade bladder cancer. Sci. Rep. 7, 1–11 (2017).
51. Cala, M., Aldana, J., Sánchez, J., Guio, J. & Meesters, R. J. W. Urinary metabolite and lipid alterations in Colombian Hispanic
women with breast cancer: A pilot study. J. Pharm. Biomed. Anal. 152, 234–241 (2018).
52. Fernández-Peralbo, M. A. et al. Prostate cancer patients-negative biopsy controls discrimination by untargeted metabolomics
analysis of urine by LC-QTOF: Upstream information on other omics. Sci. Rep. 6, 1–11 (2016).
53. Lima, A. R. et al. New ndings on urinary prostate cancer metabolome through combined GC–MS and 1H NMR analytical plat-
forms. Metabolomics 16, 1–9 (2020).
54. Poli, D. et al. Determination of aldehydes in exhaled breath of patients with lung cancer by means of on-ber-derivatisation
SPME–GC/MS. J. Chromatogr. B 878, 2643–2651 (2010).
55. Rodrigues, D. et al. Volatile metabolomic signature of bladder cancer cell lines based on gas chromatography–mass spectrometry.
Metabolomics 14, 1–15 (2018).
56. Slupsky, C. M. et al. Investigations of the eects of gender, diurnal variation, and age in human urinary metabolomic proles. Anal.
Chem. 79, 6995–7004 (2007).
57. Costanzo, M. et al. Sex dierences in the human metabolome. Biol. Sex Dier. 13, 1–18 (2022).
58. Fan, S. et al. Sex-associated dierences in baseline urinary metabolites of healthy adults. Sci. Rep. 8, 1–11 (2018).
59. Vignoli, A., Tenori, L., Luchinat, C. & Saccenti, E. Age and sex eects on plasma metabolite association networks in healthy subjects.
J. Proteome Res. 17, 97–107 (2018).
60. Bryan, G. T. e role of urinary tryptophan metabolites in the etiology of bladder cancer. Am. J. Clin. Nutr. 24, 841–847 (1971).
15
Vol.:(0123456789)
Scientic Reports | (2023) 13:9802 | https://doi.org/10.1038/s41598-023-36874-y
www.nature.com/scientificreports/
61. Alberice, J. V. et al. Searching for urine biomarkers of bladder cancer recurrence using a liquid chromatography–mass spectrometry
and capillary electrophoresis–mass spectrometry metabolomics approach. J. Chromatogr. A 1318, 163–170 (2013).
62. Kim, J. W. et al. Metabolomic screening and star pattern recognition by urinary amino acid prole analysis from bladder cancer
patients. Metabolomics 6, 202–206 (2010).
63. Ossoliński, K. et al. Metabolomic and elemental proling of blood serum in bladder cancer. J. Pharm. Anal. 12, 889–900 (2022).
64. Lee, S. H. et al. Tryptophan–kynurenine ratio as a biomarker of bladder cancer. BJU Int. 127, 445–453 (2021).
65. Park, S. Y. & Nam, J. S. Kynurenine pathway enzyme KMO in cancer progression: A tip of the Iceberg. EBioMedicine https:// doi.
org/ 10. 1016/j. ebiom. 2020. 102762 (2020).
66. Platten, M., Nollen, E. A. A., Röhrig, U. F., Fallarino, F. & Opitz, C. A. Tryptophan metabolism as a common therapeutic target in
cancer, neurodegeneration and beyond. Nat. Rev. Drug Discov. 18, 379–401 (2019).
67. Fattahi, M. J., Haghshenas, M. R. & Ghaderi, A. Immunometabolism in the bladder cancer microenvironment. Endocr. Metab.
Immune Disord. Drug Targ. 22, 1201–1216 (2022).
Acknowledgements
Research was supported mainly by National Science Centre (Poland), research project SONATA Number
UMO-2018/31/D/ST4/00109.
Author contributions
J.N.: Conceptualization, Methodology, Formal analysis, Investigation, Resources, Data Curation, Writing—Origi-
nal dra, Writing—Review & Editing, Visualization, Supervision, Project administration, Funding acquisition,
K.O: Investigation, Resources; Writing—Original dra; A. P.: Investigation; Data Curation; A.K.: Investigation,
Data Curation; A.O.: Resources; T.O.: Resources; A. N.: Writing—Original dra T.R.: Methodology, Resources,
Data Curation, Writing—Review & Editing, Supervision.
Competing interests
e authors declare no competing interests.
Additional information
Supplementary Information e online version contains supplementary material available at https:// doi. org/
10. 1038/ s41598- 023- 36874-y.
Correspondence and requests for materials should be addressed to J.N.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and
institutional aliations.
Open Access is article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International
License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or
format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the
Creative Commons licence, and indicate if changes were made. e images or other third party material in this
article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the
material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not
permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from
the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creat iveco mmons. org/ licen ses/ by/4. 0/.
© e Author(s) 2023